異源黑色素瘤DNA疫苗結(jié)合佐劑治療鼠黑色素瘤的研究.pdf

1、惡性黑色素瘤是一種具有高度轉(zhuǎn)移性的惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)的黑色素瘤致死率一直居高不下。近年來(lái)，隨著酪氨酸激酶相關(guān)蛋白-2(tyrosinase related protein2,TRP-2)和gp100等黑色素瘤相關(guān)抗原研究的日益深入，黑色素瘤DNA疫苗得到了極大的發(fā)展。然而，盡管已經(jīng)在治療惡性黑色素瘤方面取得了可喜成績(jī)，黑色素瘤 DNA疫苗仍然存在著容易引發(fā)免疫耐受、誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答微弱等問(wèn)題亟待解決。
　　TRP-2和gp100在

2、人類(lèi)黑色素瘤中高度表達(dá)，并且在同源的鼠類(lèi)黑色素瘤中有類(lèi)似現(xiàn)象。鼠源gp100(mgp100)和鼠源TRP-2(mTRP-2)在小鼠體內(nèi)容易引發(fā)免疫耐受，導(dǎo)致小鼠難以產(chǎn)生有效的保護(hù)性免疫應(yīng)答反應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們嘗試著使用異源黑色素瘤相關(guān)抗原來(lái)打破這些免疫耐受反應(yīng)，提高黑色素瘤DNA疫苗的抗腫瘤效果。然而，DNA疫苗本身難以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)，還需要使用適當(dāng)?shù)淖魟┘訌?qiáng)其效果。因此，我們選擇了基因佐劑Ii-PADRE(invariant

3、 Pan DR reactive epitope)和鼠源白介素12(murine interleukin-12,mIL-12)配合我們的黑色素瘤疫苗。此外，癌癥患者體內(nèi)的調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞可能會(huì)抑制針對(duì)自身腫瘤抗原如gp100和TRP-2的抗腫瘤免疫應(yīng)答。我們使用地尼白介素(denile ukin diftitox,ONTAK)去除Tregs，以便于疫苗更好的發(fā)揮功效。
　　我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，電脈沖法免疫人源gp100(h

4、gp100)和人源TRP-2(hTRP-2)黑色素瘤DNA疫苗(phgp100和phTRP-2)在B16F10腫瘤模型中表現(xiàn)出了顯著的保護(hù)作用。因此，異源gp100和TRP-2對(duì)于打破這些同源抗原引起的免疫耐受是十分必要的；ELISPOT結(jié)果顯示，phgp100、phTRP-2和pIi-PADRE共同免疫使得抗TRP-2的IFN-γ分泌細(xì)胞的數(shù)量增加了近2倍，體外抗B16F10細(xì)胞的毒性細(xì)胞的數(shù)量增加了近4倍。而phTRP-2、phgp

5、100和pIi-PADRE(肌肉免疫)結(jié)合3次注射pmIL-12(瘤內(nèi)免疫)免疫的方案治療效果最佳，該方案免疫小鼠的無(wú)瘤生存率達(dá)到了75％，且皮下建立的B16F10腫瘤得以有效消退；此外，我們發(fā)現(xiàn)疫苗免疫前一天腹腔注射ONTAK去除Treg細(xì)胞，結(jié)果ONTAK去除Treg細(xì)胞后phTRP-2和phgp100的抗腫瘤效果得到了進(jìn)一步的提升。
　　綜上所述，2種異源黑色素瘤DNA疫苗(phgp100和phTRP-2)共同免疫可顯著提高

6、機(jī)體對(duì)B16F10黑色素瘤的保護(hù)作用；以O(shè)NTAK去除Treg細(xì)胞可以進(jìn)一步增加癌癥疫苗效果；而最有效的治療策略是phgp100和phTRP-2疫苗結(jié)合基因佐劑pIi-PADRE和pmIL-12共同免疫。該方案可以在不去除Treg細(xì)胞的情況下完全消退建立的B16F10腫瘤，有效的延續(xù)小鼠的存活時(shí)間并且防止病情復(fù)發(fā)。
　　棘皮類(lèi)微管相關(guān)樣蛋白-4-間變型淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule-associated

7、protein-like4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK)融合致瘤基因是非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的潛在的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。然而，表達(dá)量低下和基因損傷等原因使得 EML4-ALK難以通過(guò)常規(guī)方法檢測(cè)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們嘗試使用基于新型ALK和EML4單克隆抗體的原位鄰位連接技術(shù)(in situ proximity ligation assa

8、y,isPLA)高效靈敏的檢測(cè)EML4-ALK融合致瘤蛋白。我們使用新型isPLA系統(tǒng)檢測(cè)了25個(gè)NSCLC活檢樣品（包括福爾馬林固定，石蠟包埋(formalin-fixed,paraffin-embedded,FFPE)樣品和新鮮冰凍(fresh-frozen,FrFr)樣品）中的EML4-ALK分布情況。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PC