鹽酸戊乙奎醚預(yù)先給藥對新生大鼠內(nèi)毒素性腎臟損傷的影響.pdf

1、新生兒急性腎損傷是NICU的常見疾病之一。雖然關(guān)于新生兒腎損傷的研究還相對較少，但是新生兒急性腎損傷卻很常見。且由急性腎損傷造成的死亡也很常見，晚期極易造成腎功能不全，在極低體重新生兒以及合并其它疾病者更甚。近年來，對新生兒急性腎損傷的研究日漸增多。新生兒的血流動力學(xué)最突出的特點是血容量低下，腎臟的灌注量也低。因此，在休克、感染、低體溫等各種病理狀態(tài)下，新生兒的腎功能更易遭到損害，引起新生兒腎損傷。由內(nèi)毒素所致的急性腎功能衰竭的死亡率約

2、占70％。目前，關(guān)于內(nèi)毒素性急性腎功能衰竭的病理機制還不明確。脂多糖（LPS）作為內(nèi)毒素，廣泛應(yīng)用于動物內(nèi)毒素性臟器損傷模型的制備過程中。內(nèi)毒素性腎損傷時腎臟的血流動力學(xué)發(fā)生改變，微循環(huán)障礙，使機體呈現(xiàn)缺血缺氧狀態(tài)；且內(nèi)毒素性腎損傷時，腎臟谷氨酰胺的耗竭加速，腎小管上皮細胞的氧化代謝也發(fā)生障礙。有研究表明缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α，作為低氧時發(fā)揮作用的調(diào)控基因，可在缺氧條件下產(chǎn)生核蛋白，與其靶基因結(jié)合，使機體對缺氧環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)性改變，且內(nèi)

3、毒素性腎損傷時HIF-1α過表達。HIF-1α可通過NF-κB途徑促發(fā)炎性因子的釋放，加重腎臟的損害；另有研究表明，谷氨酰胺Gln作為腎臟糖異生的底物，以及腎小管細胞氧化代謝的燃料，在內(nèi)毒素血癥發(fā)生時可以抑制腎小管上皮細胞的凋亡，且可以減緩線粒體呼吸功能受抑制程度。鹽酸戊乙奎醚（PHC）是一種廣泛應(yīng)用于臨床麻醉中的新型抗膽堿藥。很多研究表明，其在改善休克患者的微循環(huán)、減輕內(nèi)臟多器官的損傷方面發(fā)揮著重要作用，可視為糾正內(nèi)毒素性休克時微循環(huán)

4、痙攣理想的血管活性藥物。且在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，鹽酸戊乙奎醚可通過調(diào)節(jié)HIF-1α和Gln的表達來降低內(nèi)毒素性腸損傷，且我們通過大量的臨床案例觀察到鹽酸戊乙奎醚的應(yīng)用可以明顯改善內(nèi)毒素性急性腎損傷時腎臟的功能。因此，本研究制備的模型為LPS致新生7日齡大鼠急性內(nèi)毒素性腎損傷，探討預(yù)先使用抗膽堿藥鹽酸戊乙奎醚對腎組織HIF-1α和Gln表達的影響，進一步探討其具體作用機制。
　　目的
　　觀察新生大鼠內(nèi)毒素性急性腎損傷時腎組織中

5、HIF-1α以及Gln的表達；以鹽酸戊乙奎醚預(yù)先給藥為干預(yù)手段，觀察其對新生大鼠內(nèi)毒素性腎損傷時HIF-1α以及Gln的表達的影響；探討鹽酸戊乙奎醚預(yù)先給藥對內(nèi)毒素性腎損傷時實現(xiàn)腎臟保護作用的具體機制，以期找到新的治療途徑來面對新生兒內(nèi)毒素性腎損傷。
　　材料與方法
　　1實驗對象
　　SD大鼠72只（1周齡，SPF級，健康）；購于河南省實驗動物中心（鄭州大學(xué)），不限雌雄，體重15.0~18.0g。
　　2實驗方

6、法
　　2.1實驗對象分組
　　依據(jù)研究內(nèi)容，將實驗動物隨機分為兩部分:48只和24只。第一部分：取48只，根據(jù)隨機數(shù)字表法將其分為3組，每組16只（n=16）。分別為C組：對照組（PBS液）；K組：LPS腎損傷組和P組：PHC組。此部分實驗動物于造模后觀察其行為學(xué)方面及精神狀態(tài)的變化，并計算各組造模后24h時的死亡率。第二部分：隨機將剩余的24只新生鼠分為C組、K組和P組，每組8只。此部分實驗用于觀察三組間腎組織HIF-1

7、α和Gln以及相關(guān)因子的表達、腎組織濕/干重比的測定以及光鏡下觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)改變。
　　2.2動物模型的制備
　　兩部分實驗動物同時制模。
　　C組：腹腔注射PBS液10ml/kg；
　　P組：腹腔PHC2mg/kg注射，將濃度稀釋至0.10mg/ml；
　　K組：腹腔LPS5mg/kg注射，將濃度稀釋至1.0mg/ml。
　　給藥方式：P組和K組均注射LPS，P組LPS注射前30min注射PH

8、C。腹腔注射部位要求一致，回抽無血無氣體。
　　實驗動物于制模后標(biāo)記清楚，放回鼠籠與母鼠共同喂養(yǎng)，保持喂養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定。第二部分老鼠于造模后6小時時麻醉，取材，凍存，備用。
　　2.3腎組織的標(biāo)本采集
　　腹腔注射3ml/kg的10%水合氯醛進行麻醉，麻醉后接小動物呼吸機，將老鼠以背臥位固定于手術(shù)臺上。從胸部正中剪開2.0~2.5cm，暴露肋骨和肌肉，觸摸到心尖的搏動后，使用注射器（5號針頭）進行心臟采血。將血標(biāo)本于室溫

9、下（22℃~25℃）靜置1小時，1200r/min離心10分鐘，取上清液，-80℃冰箱中保存待檢。開腹后取下左右兩腎。右腎上二分之一，勻漿處理，用于HIF-1α、Gln等指標(biāo)的檢測；右腎下二分之一，使用Trizol法提取RNA，RT-PCR法檢測HIF-1αmRNA的表達；左腎上二分之一用于腎濕/干重比的檢測；左腎下二分之一，HE染色后，觀察其病理學(xué)改變。
　　2.4檢測指標(biāo)
　　2.4.1計算腎組織濕/干重比（W/D）

10、r>　　使用濾紙吸取多余水分后，電子天平稱量左腎上二分之一，并記錄濕重。繼而放入70℃恒溫烘干箱48小時，行稱量，記錄干重，計算濕/干重比。
　　2.4.2腎組織形態(tài)學(xué)觀察
　　將左腎下二分之一組織放入10%多聚甲醛（多聚甲醛體積大于腎組織體積的3倍）中48小時使其固定充分。石蠟包埋，HE染色。400倍光鏡下觀察腎的組織結(jié)構(gòu)病理學(xué)改變。
　　2.4.3 ELISA法測定腎組織中TNF-α、IL-6、HIF-1α、Gln

11、的含量
　　對右腎上二分之一腎組織進行稱重，取緩沖液PBS，以1/9容量比配置，使用勻漿器制備組織勻漿。3500r/min離心10分鐘，取上清，于-80℃冰箱中保存待使用。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒（R&D公司，美國）的使用說明書檢測TNF-α、IL-6、HIF-1α、Gln的表達。
　　2.4.4 RT-PCR法測定腎組織HIF-1αmRNA的表達
　　將右腎下二分之一組織經(jīng)DEPC水沖洗后濾紙吸干，于液氮中速凍后，隨

12、后置入-80℃冰箱保存待檢。使用Trizol法提取腎臟的RNA，HIF-1αmRNA在新生鼠腎組織的表達經(jīng)步驟：反轉(zhuǎn)錄、DNA擴增、糖瓊脂糖凝膠電泳等檢測。
　　3統(tǒng)計學(xué)方法處理
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x± s)表示計量資料，多組間比較單因素方差分析，兩兩之間相比較采用最小顯著差異法（LSD-t），設(shè)定檢驗水準(zhǔn)為α=0.05，即P值當(dāng)小于檢驗水準(zhǔn)時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　

13、　結(jié)果
　　1.生存狀態(tài)觀察腹腔注射LPS后，1小時后K組新生鼠開始顫抖，呼吸頻率增快。于3小時后全身顏色呈現(xiàn)灰白色，活動遲緩，體溫明顯降低。6小時后皮膚顏色較3小時時更甚，不活動也不進食，口唇青紫，呈現(xiàn)嚴(yán)重缺氧狀態(tài)。同時期P組新生鼠癥狀較K組狀態(tài)有明顯改善。C組新生鼠活動、進食及精神狀態(tài)等情況皆正常。C組、P組及K組的24h死亡率分別為0%、12.4%和50%。
　　2.腎組織的濕/干重比的結(jié)果：P組和K組較之于C組均有明

14、顯升高（P<0.05）；P組較之于K組，顯著降低（P<0.05）；各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.腎組織病理學(xué)結(jié)果顯示：C組腎組織形態(tài)學(xué)無明顯改變，基本正常。K組腎小管上皮細胞明顯腫脹，管腔變窄，充血，水腫，部分腎小管上皮細胞空泡化變形或者透明樣變性。管腔內(nèi)可見大量的脫落細胞、紅細胞和細胞管型，間質(zhì)血管擴張充血，且大量炎性細胞浸潤。與K組比較，P組腎小管上皮細胞腫脹明顯減輕，間質(zhì)少許充血以及炎性細胞浸潤，病理改變有明顯改善

15、。
　　4. P組和K組腎組織中的HIF-1α、IL-6、TNF-α含量較之于C組均有顯著增加（P<0.05），Gln含量顯著降低（P<0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；較之于K組，P組腎組織中IL-6、TNF-α、HIF-1α含量均較低，Gln的含量較高（P<0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5. HIF-1αmRNA在腎組織中的表達結(jié)果：K組和P組較之于C組，均明顯增加（P<0.05）；P組較之于與K組，明顯降低（P<0.