活化基因序列串聯(lián)拷貝數(shù)目對GFP報告基因表達(dá)的影響及核心序列分析.pdf

1、目的:淋巴細(xì)胞的抗原受體發(fā)生等位基因排斥,又稱單等位基因表達(dá),來自父方和母方的抗原受體等位基因在成熟的淋巴細(xì)胞中只有一個表現(xiàn)活性。B淋巴細(xì)胞單等位基因表達(dá)抗原受體(BCR)是通過沉默兩個同源抗原受體之一完成,如果沒有等位基因排斥,相同的B細(xì)胞將產(chǎn)生兩個不同的重鏈和4個不同的輕鏈(兩個kappa,兩個lambda),假定不同的重鏈和輕鏈獨(dú)立互相結(jié)合,可以產(chǎn)生30種不同的異4聚體,不利于抗體對抗原的識別,而等位基因排斥保證表達(dá)有效的多價抗體

2、分子,保證一個B細(xì)胞僅產(chǎn)生一種BCR。等位基因排斥似乎是一種普遍的表觀遺傳現(xiàn)象,嗅神經(jīng)受體等位基因排斥保證嗅覺識別的精確性,X染色體失活保證染色體環(huán)境的平衡,均發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。這些現(xiàn)象自上世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)以來一直是積極研究的課題,但是至今仍然不能明確其發(fā)生機(jī)理。
　　 幾十年來,研究者將大部分注意力集中在編碼蛋白質(zhì)的基因和蛋白質(zhì)上,隨著人和小鼠基因組測序工作的完成和多細(xì)胞真核生物基因表達(dá)調(diào)節(jié)資料的積累,研究熱點(diǎn)已經(jīng)轉(zhuǎn)移到非

3、編碼序列(包括重復(fù)序列),非編碼DNA中包含著重要的有關(guān)生物發(fā)育和生理的遺傳資料。蛋白質(zhì)在等位基因排斥中的作用已經(jīng)有一些文獻(xiàn)報道,涉及的蛋白質(zhì)有NFкВ轉(zhuǎn)錄復(fù)合物等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在啟動子部位,促進(jìn)基因表達(dá)。但是這些轉(zhuǎn)錄因子并不是T,B細(xì)胞特異的,其他基因也使用這些轉(zhuǎn)錄因子,顯然還有起作用的其他的環(huán)節(jié)。典型的等位排斥基因(VH,Vκ,Vλ,TCRβα,TCRδ,TCRβ,TCRγ,嗅神經(jīng)受體)都有多個同源基因成簇分布的傾向,如

4、VH基因簇有約100個VH基因片段串連;人的X染色體有30％的Line-1重復(fù)序列,而其他染色體只有15％的Line-1分布。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),單等位表達(dá)基因及其側(cè)翼含有更多的Line-1。這些發(fā)現(xiàn)提示,相同或類似序列成簇分布(即重復(fù)序列成簇分布)的基因組學(xué)特征可能與等位基因排斥存在關(guān)聯(lián),這是需要用實驗進(jìn)一步驗證的科學(xué)問題,但是目前對于成簇分布的基因組學(xué)特征在等位基因排斥方面所起的作用缺乏研究。根據(jù)基因組學(xué)的發(fā)現(xiàn),等位排斥基因均有重復(fù)

5、序列成簇分布的傾向,TCR,BCR,嗅神經(jīng)受體等位基因排斥和X染色體失活可能有相同的基礎(chǔ)。
　　 TCR,BCR和嗅神經(jīng)受體等位基因排斥,不僅表現(xiàn)在等位基因,而且也表現(xiàn)在非等位的同類基因,和順式排列(cis)的同類基因,例如BCR的κ鏈和λ鏈,盡管不是等位基因也發(fā)生排斥;1000多個嗅神經(jīng)受體成簇分布在基因組的多條染色體上,只有一個可以表達(dá)。所以說,等位基因排斥過程中即對同源染色體的等位基因發(fā)揮作用,也對非同源染色體的同類基因發(fā)

6、揮作用,還對順式排列的同類基因發(fā)揮作用。
　　 本研究室的前期工作發(fā)現(xiàn),Line-1和Alu重復(fù)序列以串聯(lián)形式插入質(zhì)粒的GFP基因下游顯著抑制GFP基因表達(dá),在GFP基因和插入的串聯(lián)序列之間插入SV40PolyA可以解除串聯(lián)序列對基因表達(dá)的抑制作用。這就提出以下問題:SV40PolyA中的何種序列活化基因,這些活化基因的序列如果串聯(lián)之后活化基因作用增強(qiáng)還是減弱,活化基因的序列中核心序列是什么。抑制基因的序列隨串聯(lián)拷貝數(shù)增加,抑制

7、基因的作用上升,活化基因的元件如果串聯(lián)長了會對基因表達(dá)產(chǎn)生何種影響?用實驗回答這些問題對于認(rèn)識等位基因排斥會有幫助。
　　 方法:1、合成引物和作為模板的DNA片段委托DNA合成公司合成帶適當(dāng)酶切位點(diǎn)的引物,合成帶有不同突變位點(diǎn)或突變部位的DNA片段作為模板。表1為本論文所使用的人工合成寡核苷酸序列及其名稱。
　　 2、表達(dá)載體構(gòu)建用帶有合適酶切位點(diǎn)的引物,PCR擴(kuò)增目的片段,目的片段包括質(zhì)粒中的DNA序列和合成的DNA

8、片段,酶切后插入pEGFP-C1質(zhì)粒,獲得插有一個片段的表達(dá)載體,利用Xba I/Nhe I酶切位點(diǎn)可以用T4 DNA連接酶連接,但是連接以后的位點(diǎn)不能被其中的任何一個酶切斷的特性制備同向二串聯(lián)體。
　　 3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和熒光觀察將表達(dá)載體用LipofectamineTM2000瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,熒光顯微鏡下計數(shù)觀察GFP熒光陽性細(xì)胞數(shù)。
　　 4、Northern雜交用9N隨機(jī)引物和大腸桿菌DNA聚合酶大片段,將α-

9、32P-dCTP摻入DNA中制備GFP探針。提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA,甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳,將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜。32p標(biāo)記的GFP探針雜交、沖洗后通過放射自顯影記錄實驗結(jié)果。然后,這種雜交過的尼龍膜用剝離液處理,去除32P-GFP探針,用檢測neo RNA的探針再次雜交,放射自顯影作為轉(zhuǎn)染效率的對照。擴(kuò)增GFP和Neo模板的引物見表1。
　　 結(jié)論:1、PolyA正、反序列均可以解除Alu14對GFP基因的抑制作用;將PolyA

10、反序分成60bp一段,其中中間的兩段即2F2R和3F3R可以活化基因,兩端的兩段沒有活化基因作用。
　　 2、2-4個2F2R拷貝活化基因作用最強(qiáng),超過以后隨串連拷貝數(shù)增加活化基因作用下降。
　　 3、2個3F3R拷貝活化基因作用最強(qiáng),超過以后隨串連拷貝數(shù)增加活化基因作用下降,與2F2R的趨勢相同。
　　 4、對3F3R進(jìn)行堿基刪減分析,發(fā)現(xiàn)從3F3R上游算起第9個堿基到第41堿基的序列包含活化基因的核心序列(5