中國漢族人群先天性心臟病全基因組關聯(lián)研究.pdf

1、先天性心臟病(Congenital heart disease，CHD)，簡稱先心，是圍產兒最常見的出生缺陷。世界范圍內先心的發(fā)病率在足月、活產的新生兒約為0.80％，在成年人中約為0.40％，其中散發(fā)型非綜合征型先心患者占絕大多數。我國衛(wèi)生部2012年9月發(fā)布的《中國出生缺陷防治報告》數據顯示，我國圍產期先心發(fā)病率呈快速上升趨勢，每年新增病例18萬～22萬。
　　心臟發(fā)育經歷了心管形成、環(huán)化、內部分隔、血管連接等過程，任何環(huán)節(jié)遭

2、到干擾都可能引起先天性缺陷。流行病學研究顯示，盡管環(huán)境危險因素與先心發(fā)病有關，但在致病過程中發(fā)揮主導作用的是遺傳危險因素。先心的表型復雜多樣，臨床亞型多達幾十種，其病因機制存在明顯的異質性。本課題組對先心復雜的遺傳危險因素如單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）等進行了一系列研究。但目前，針對先心開展的全基因組關聯(lián)研究(Genome-wideAssociation Studies，GWAS

3、)還未有報道。
　　近年來，GWAS已經逐漸成為人們探究常見復雜性疾病遺傳易感性的有力“武器”，它的優(yōu)勢在于不基于任何病因假設，不局限于已知基因/通路，能夠將研究范圍擴大到整個基因組的遺傳變異，可為先心遺傳易感因素研究提供新的線索?；诙嚯A段病例-對照研究設計，我們首次在中國人群中開展先心GWAS研究，對大樣本人群全基因組SNPs進行掃描，繼而在獨立病例-對照樣本中進行多階段驗證，探究與中國人群先心發(fā)病風險相關的常見易感位點。為了

4、控制遺傳異質性的影響，鑒別真正的遺傳危險因素，本研究選擇先天性心臟間隔缺損患者作為主要研究對象，包括房間隔缺損(Atrial septal defects，ASD)、室間隔缺損(Ventricular septal defects，VSD)及房間隔缺損合并室間隔缺損(ASD/VSD)。在此基礎上，我們還對由于頻率較低或效應微弱未能被GWAS闡明的部分位點進一步擴大樣本驗證，以期發(fā)現(xiàn)更多與先心發(fā)病風險顯著相關的常見遺傳變異。
　　本

5、研究作為首個在中國人群中開展的先心GWAS，將有助于我們發(fā)現(xiàn)新的中國人群遺傳易感位點，提示易感基因及通路，為先心的分子生物學研究提供線索;新發(fā)現(xiàn)的易感位點能夠增加人們對先心遺傳貢獻的認知，完善先心遺傳易感圖譜;此外，還有望將新發(fā)現(xiàn)的標志物用于遺傳學咨詢，預測人群子代先心患病風險，篩查子代先心高危人群，并為早期診斷和治療提供數據支持。
　　第一部分中國漢族人群先天性心臟病全基因組關聯(lián)研究
　　近年來，全世界范圍內先心發(fā)病率不斷

6、攀升，已經成為最常見的出生缺陷，嚴重影響人類生命健康。既往研究表明，先心作為一種復雜性疾病，是由環(huán)境因素與個體遺傳因素共同決定的，其中遺傳因素發(fā)揮主導作用。研究者們對先心遺傳易感性的研究多基于候選基因策略，并且僅有少數已知致病基因上的少數遺傳變異被發(fā)現(xiàn)與先心發(fā)病風險有關。關于先天性心臟病的GWAS研究目前還尚未有相關報道。因此，開展先心GWAS將有望幫助人們發(fā)現(xiàn)更多中低外顯度的先心常見遺傳易感位點。
　　本研究運用高通量分型平臺—

7、Illumina HumanOmniZhonghua-8全基因組基因分型芯片，對945名明確診斷為散發(fā)型非綜合征型先心(ASD、VSD以及ASD/VSD)患者及1246名來自同一地區(qū)、無出生缺陷和心臟疾病的對照進行了全基因組常見遺傳變異檢測。經過嚴格的質量控制，我們我們運用logistics回歸中的相加模型對708275個合格SNPs進行了關聯(lián)分析。8個SNPs在病例和對照中差異顯著（關聯(lián)研究中P≤1×10-5為驗證標準）進入后續(xù)三階段

8、獨立樣本驗證，驗證平臺采用Taqman基因分型平臺。第一、第二階段驗證樣本為來自南京和西安地區(qū)的2160名先心(ASD、VSD以及ASD/VSD)患者及3866名對照。結果顯示，rs2474937在兩階段驗證中均顯示出與先心發(fā)生風險顯著相關，與初篩一致，其突變基因型[C]顯著增加先心發(fā)生風險（第一階段:OR=1.35，P=9.97×10-5;第二階段:OR=1.27，P=9.97×10-5）。rs1531070在先心病例和對照中的頻率也

9、表現(xiàn)出顯著差異，其突變基因型[A]與先心發(fā)生風險增加顯著相關（第一階段:OR=1.29，P=2.70×10-4;第二階段:OR=1.36，P=2.32×10-3）。進入驗證階段的其余6個、 SNP(rs17019472，rs10182004，rs9461938，rs72759270，rs9533839和rs9533839)的基因型與發(fā)病風險無顯著關聯(lián)(P＞0.05)。合并初篩及第一、二階段驗證所有樣本后分析顯示，兩個陽性SNPs的變異等

10、位基因型分別顯著增加先心的發(fā)病風險至1.40倍，并且均達到GWAS研究統(tǒng)計學顯著水平(rs2474937P=8.44×10-10，rs1531070 P=4.99×10-12)。為了探究其他先心亞型中SNP的關聯(lián)情況，我們特別納入了1180名除了ASD、VSD及ASD/VSD外的其他先心亞型來進行第三階段驗證。結果顯示，兩個SNPs與其他亞型先心發(fā)生風險也顯著相關(rs2474937 OR=1.32,P=2.00×10-3; rs153

11、1070 OR=1.20,P=1.40×10-2)。我們進一步根據先心不同亞型進行分層分析。本研究中納入的先心患者主要亞型有4種—ASD、VSD、ASD/VSD以及PDA。結果發(fā)現(xiàn)這兩個SNPs與四種先心的關聯(lián)強度類似，OR介于1.30至1.58之間，并且亞組間異質性分析沒有發(fā)現(xiàn)顯著異質性（rs2474937的異質性檢驗P=0.546;rs1531070的異質性檢驗P=0.428）。
　　綜上所述，本研究鑒定了位于1p12和4q3

12、1.1的中國人群先心易感區(qū)域，填補了先心GWAS研究數據的空白，發(fā)現(xiàn)的遺傳易感位點可為先心的早期篩查提供候選標志物。
　　第二部分中國漢族人群先天性心臟病全基因組關聯(lián)研究擴大驗證
　　如第一部分所述，本課題組開展了首個中國人群先心GWAS研究，采用大樣本、多階段病例-對照研究設計，發(fā)現(xiàn)了2個中國人群易感區(qū)域—1p12和4q31.1區(qū)域。與此同時，英國的紐卡斯爾大學Cordell等人在高加索人群中開展了先心GWAS研究，發(fā)現(xiàn)了

13、與歐洲人群ASD和法洛四聯(lián)癥(Tetralogy of Fallot，TOF)發(fā)生風險顯著相關的常見遺傳變異。這些GWAS研究為進一步探索先心分子生物學機制提供了非常有價值的線索。
　　然而，GWAS研究一般僅選擇少數關聯(lián)P值最小的峰值SNPs進行后續(xù)驗證，在降低假陽性的同時可能遺漏了大最效應較弱的易感位點和（或）區(qū)域，因此每個GWAS研究均只鑒別到少數遺傳易感位點，能夠解釋的遺傳力非常有限。為了發(fā)現(xiàn)更多的易感位點和（或）區(qū)域，我

14、們降低篩選標準，擴大驗證范圍，對全基因組關聯(lián)分析中P值1.0×10-4-1.0×10-5的45個候選SNPs進行驗證。第一階段驗證采用Sequenom MassARRAY分型平臺，驗證人群為來源于南京的2270名先心(ASD，VSD，ASD/VSD)患者及3911名對照。4個SNPs與先心發(fā)生風險有顯著關聯(lián)—rs1400558，rs7863990和rs490514的變異基因型均能夠顯著增加先心發(fā)生風險(rs1400558 OR=1.13

15、，P=1.18×103; rs7863990 OR=1.20，P=3.00×10-3;rs490514 OR=1.15，P=8.75×10-5)，而rs2433752的變異基因型與先心風險降低有顯著關聯(lián)（OR=0.86，P=8.31×10-4）。其余41個SNPs基因型頻率在病例和對照中的差異沒有統(tǒng)計學意義。對4個顯著關聯(lián)SNPs進行第二階段驗證，納入來自西安的1095例ASD、VSD以及ASD/VSD患者及2379名非先心對照。基因分

16、型采用Taqman分型平臺，結果顯示驗證的4個SNPs都與先心發(fā)生風險顯著相關（P≤0.05），并且效應方向與初篩及第一階段驗證保持一致(rs1400558 OR=1.15，P=9.11×10-3; rs7863990 OR=1.28,P=6.30×10-3; rs2433752 OR=0.79，P=4.68×10-4;rs490514 OR=1.16，P=5.33×10-3)。此外，我們納入來自南京和西安的2188名除ASD、VSD以

17、及ASD/VSD外的其他類型先心患者和來自于同地區(qū)的1120名非先心對照作為第三階段驗證人群，結果表明這4個SNPs也與其他亞型先心發(fā)生風險顯著相關(rs1400558 OR=1.18，P=2.91×10-3; rs7863990 OR=1.45，P=1.76×10-5; rs2433752 OR=0.82，P=1.23×10-3; rs490514OR=1.22，P=1.96×10-4)。
　　我們對本研究中包括各種亞型先心在內

18、的全部病例及全部對照進行合并分析，結果顯示rs14005584，rs7863990和rs490514這3個SNPs的突變基因型都能顯著增加先心發(fā)病風險，而rs2433752的突變基因型則能夠顯著降低先心發(fā)生風險，并且均達到GWAS研究統(tǒng)計學顯著水平（rs1400558 OR=1.15，P=1.63×10-9;rs7863990OR=1.34，P=3.71×10-14; rs2433752 OR=0.83，P=1.04×10-10; rs

19、490514OR=1.19，P=1.20×10-13)。此外，我們與英國Cordell課題組合作，歐洲人群中發(fā)現(xiàn)rs490514也與歐洲人群先心發(fā)病風險顯著相關（OR=1.18，P=3.40×10-3）。
　　進一步在本研究中涉及的5種主要先心亞型—ASD、VSD、ASD/VSD、PDA以及TOF中對上述的4個陽性SNPs進行分層分析，發(fā)現(xiàn)rs2433752和rs490514與5種先心亞型發(fā)病風險的關聯(lián)方向相同，亞組間關聯(lián)強度無顯

20、著異質性（rs2433752異質性P=0.249; rs490514異質性P=0.193）。而對rs1400558和rs7863990的分析結果則顯示，它們對不同亞型的效應有顯著性差異（異質性P值分別為0.015和0.007）。rs1400558的突變基因型能顯著增加其他4種亞型的發(fā)生風險，但在對PDA的分析中得到相反的效應方向，關聯(lián)達不到顯著性水平（OR=0.88，P=1.24×10-1）;rs7863990與5種亞型間都有顯著關聯(lián)，