人類蛋白磷酸酶基因PP2Cκ和類固醇脫氫酶基因HSDL2的功能研究.pdf

1、本論文分兩個部分，分別研究了作為細胞信號通路調節(jié)基因的PP20c和作為化學小分子代謝相關基因的HSDL2的初步生物學功能。 蛋白質的磷酸化／去磷酸化作用是調節(jié)真核細胞內活動的一種重要方式，在細胞信號傳導、細胞周期調控等許多過程中都起到至關重要的作用。我們從人胎腦cDNA文庫中克隆到一個新的蛋白磷酸酶基因，PP2Cκ，其cDNA全長2034bp，編碼一個372個氨基酸殘基的蛋白質，該蛋白具有一個完整的蛋白磷酸酶2C催化結構域，屬

2、于絲蘇氨酸磷酸酶中的PP2C亞家族。PP2Cκ基因定位于人染色體4q21-22，由7個外顯子和6個內含子組成。逆轉錄PCR顯示，該基因廣泛的表達于所有我們檢測的正常成人和胎兒組織，在成人腦、卵巢、心臟、胰腺、腎組織和胎兒心臟、胸腺等組織表達量相對較高。原核表達的PP2Cκ蛋白對磷酸化的蘇氨酸多肽具有去酸磷化的絲蘇氨酸磷酸酶活性。瞬時轉染AD293細胞，發(fā)現(xiàn)PP2Cκ蛋白集中定位于細胞核內。PP2Cκ過量表達能夠顯著激活細胞內的熱休克轉錄

3、因子通路。我們通過進一步分析發(fā)現(xiàn)，PP2Cκ對熱休克轉錄因子通路的激活，很可能是通過直接與熱休克轉錄因子相互作用來實現(xiàn)的，PP2Cκ和熱休克轉錄因子1(HSF1)在細胞核內呈共定位分布，體外相互作用實驗證明二者有一定的結合能力。這為研究細胞熱休克調控通路提供了一個新的研究方向。我們還利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選可能與PP2Cκ有相互作用的蛋白，研究這些候選蛋白與PP2C~c是否真的存在有相互作用，能夠進一步揭示PP2Cκ這個廣譜表達的絲蘇氨酸

4、磷酸酶在細胞內的生物學功能。 類固醇脫氫酶參與體內固醇類物質代謝的反應，對哺乳動物的生長與發(fā)育起到了極為重要的作用。通過對人胎腦cDNA文庫的大規(guī)模的序列分析，我們克隆到一條類似類固醇脫氫酶的cDNA，命名為HSDL2。該cDNA全長3211bp，編碼一個418氨基酸的多肽。該蛋白包含了一個短鏈脫氫酶催化結構域以及一個固醇載體蛋白家族的SCP-2結構域，而且包含有短鏈脫氫酶家族典型的NAD(P)+輔酶結合位點(TGxxxGxG

5、)及酶活性位點(S-Y-K)等保守基序。蛋白質序列分析表明HSDL2蛋白與小鼠及果蠅中的同源蛋白具有較高的相似性。該基因定位于人9號染色體長臂的32區(qū)，包含了n個外顯子。逆轉錄PCR結果則顯示該蛋白在人主要組織中廣泛表達，尤其在肝、腎、前列腺、睪丸和卵巢中表達量很高。原核表達的HSDL2融合蛋白具有與輔酶NADPH結合的能力。細胞內綠熒光定位實驗顯示，該蛋白定位于細胞質中。細胞中過表達含有SCP2結構域膽固醇的HSDL2，發(fā)現(xiàn)細胞總膽固