利拉魯肽減輕心肌微血管內(nèi)皮細胞缺氧復氧損傷的機制研究.pdf

1、目的:微血管是心臟終末循環(huán)的末梢，決定了組織灌注水平和氧供平衡。心梗缺血后的再灌注時期產(chǎn)生的大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是誘導冠脈末梢的CMEC(Cardiac Microvascular Endothelial Cells，CMEC)凋亡的主要因素之一。前期研究證實，黃嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，XO)是CMEC在氧化應激條件下產(chǎn)生ROS的主要來源之一。如何減少CMEC的氧化應

2、激損傷是防治急性心肌梗死再灌注損傷的重點。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)近期被發(fā)現(xiàn)在心臟組織中具有抗氧化應激的作用。故本研究旨在探究GLP-1類似物利拉魯肽(GLP-1 Analogue，Liraglutide)對CMEC生物學特性的影響，以及缺氧復氧模型(Hypoxia/Reoxygenation Model，H/R)條件下，Liraglutide保護CMEC免受氧化應激損傷的具體機制，

3、以及提高CMEC的存活能力的分子信號通路的研究。
　　方法:雙酶消化法體外分離培養(yǎng)SD大鼠CMEC，差速貼壁法進行純化，CD31和Ⅷ因子抗體進行免疫細胞化學染色鑒定CMEC純度，CD31和GLP-1R抗體進行免疫細胞化學共染細胞。采用不同濃度Liraglutide(0～100 nM)預干預后MTT繪制細胞生長曲線，BrdU熒光標記法和劃痕實驗觀察藥物作用下細胞增殖和遷移能力。建立H/R誘導的細胞氧化應激凋亡模型，流式細胞學檢測細胞

4、凋亡率，DCFHDA熒光探針檢測胞內(nèi)ROS的變化，F(xiàn)ura-3 AM熒光探針檢測細胞內(nèi)鈣離子變化，免疫熒光染色和Western Blot檢測XO、caspase3等蛋白分子的表達情況，利用通路阻斷劑和干擾RNA技術(shù)，闡明Liraglutide通過激活PI3K/Akt-Survivin分子信號在抗細胞氧化應激過程中的保護作用機制。
　　結(jié)果:
　　1.體外分離SD乳鼠原代CMEC，72h后細胞呈典型“鋪路石樣”生長，CD31及

5、Ⅷ因子免疫熒光染色提示雙陽性率大于95％，說明CMEC純度較高。
　　2.CD31和GLP-1R抗體免疫熒光共定位染色提示CMEC表達GLP-1受體，MTT示Liraglutide以濃度依賴方式促進CMEC的體外增殖，100 nM為其最適生長濃度。
　　3.予以Liraglutide預處理細胞24 h，BrdU和劃痕實驗均說明Liraglutide能以濃度依賴性促進CMEC的增殖和遷移能力。
　　4.通過缺氧4h復氧4

6、h成功建立H/R模型，在該模型條件下可以顯著提高胞漿ROS含量、誘導細胞凋亡;而Liraglutide預處理細胞12h可以通過降低ROS、進而減少凋亡細胞數(shù)量。
　　5.H/R模型誘導黃嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，XO)表達增加，生成過量ROS及增加凋亡蛋白的表達。利用siRNA敲低XO或予以Liraglutide預處理可顯著降低胞漿ROS水平，同時降低凋亡蛋白的表達。
　　6.H/R模型條件導致細胞胞漿鈣

7、超載，誘導XO表達增加，生成過量ROS及凋亡蛋白的表達。使用BAPTA中和鈣離子或Liraglutide預處理12 h可明顯減少XO表達，降低胞漿ROS水平，同時降低凋亡蛋白的表達。
　　7.H/R模型誘導過量胞漿XO-ROS生成，最終導致了線粒體膜電位降低、細胞色素c向胞漿滲漏，線粒體凋亡通路的激活。Liraglutide預處理12h或敲低XO可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)線粒體膜電位的丟失和細胞色素c向胞漿的滲漏，從而促進細胞存活。

8、r>　　8.H/R模型通過下調(diào)SERCA2a、促進IP3R轉(zhuǎn)錄，導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣通道失衡、誘導胞漿鈣超載，從而升高XO的表達以及胞漿ROS的含量。阻斷IP3R、鰲合胞漿鈣、使用siRNA敲低XO，可以有效降低胞漿ROS水平，同時降低caspase3的表達;Liraglutide預處理12 h恢復SERCA2a的轉(zhuǎn)錄水平并下調(diào)IP3R的轉(zhuǎn)錄，抑制了H/R誘導的鈣失衡、XO的激活，最終降低胞漿過量ROS并提高細胞存活。
　　9.Lirag

9、lutide預處理12 h，CMEC中p-Akt及survivin表達量升高，給與PI3K/Akt阻斷劑LY294002后，survivin的表達下降。
　　10.H/R模型中分別阻斷PI3K/Akt、敲低survivin或阻斷GLP-1R，均可以降低Liraglutide對SERCA2a和IP3R轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用，誘發(fā)了下游鈣離子失衡、過量ROS生成，及凋亡蛋白表達增加。
　　11.Liraglutide通過提高SOD、GS

10、H和GPx的含量，維持胞內(nèi)正常ROS水平。
　　結(jié)論:
　　1.Liraglutide是以濃度依賴方式通過激活胞內(nèi)PI3K/Akt和MAPK/ERK通路促進原代大鼠CMEC的增殖和遷移。
　　2.H/R模型通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣超載誘導的細胞氧化應激損傷，導致?lián)p傷軸SR-Ca2+-XO-ROS激活，生成過量胞漿ROS，最終介導了CMEC的線粒體凋亡通路激活，而予以Liraglutide預處理可以逆轉(zhuǎn)上述過程。
　　3.