Myrothecine A通過miR-221調控肝癌細胞增殖及樹突狀細胞成熟機制的研究.pdf

1、Myrothecine A是從黃花蒿內生真菌Myrothecium roridum IFB-E012發(fā)酵產物中分離得到的、具有細胞毒性的10，13環(huán)單端孢霉烯型大環(huán)內酯類化合物。已有文獻報道了該化合物的絕對構型，并初步探討了其在內共生和生物催化方面的潛在意義。本論文旨在探討myrothecine A體外抗腫瘤的初步機制以及它在免疫調節(jié)方面的作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，miR-221是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要調節(jié)者，它能與其靶基因的3'UTR區(qū)結

2、合，在轉錄后水平對基因進行調控，起著癌基因的作用，廣泛參與腫瘤細胞增殖、分化和凋亡等過程。樹突狀細胞（Dendritic cells，DC）是目前發(fā)現(xiàn)的體內抗原遞呈功能最強大的細胞，是啟動、調控和維持免疫應答的中心環(huán)節(jié)。近年來發(fā)現(xiàn)，miRNAs能廣泛參與DC發(fā)育、分化、成熟等過程。因此，本論文從以下兩個方面探討myrothecine A對miR-221的調節(jié)作用以及對肝癌細胞增殖和DC成熟的影響:一、研究myrothecine A通過m

3、iR-221對肝癌細胞增殖的作用及機制;二、觀察myrothecineA通過miR-221對DC成熟的影響，以期為myrothecineA成為新的抗腫瘤以及免疫調節(jié)藥物提供實驗依據(jù)。
　　首先，我們研究myrothecineA通過miR-221對肝癌細胞增殖的影響及機制。我們用不同濃度的myrothecineA處理人肝癌細胞株SMMC-7721，MTT法檢測肝癌細胞的活性。結果發(fā)現(xiàn)，當myrothecineA濃度達到1μg/mL時

4、，能明顯抑制肝癌細胞的增殖，并且隨著濃度的增加，myrothecineA對肝癌細胞的抑制作用呈現(xiàn)出劑量依賴性。接下來，我們使用不同濃度的myrothecineA分別處理人肝癌細胞株SMMC-7721后，采用流式細胞術測定細胞周期，結果顯示，myrothecine A能將細胞阻滯在S期。為了進一步探討myrothecine A誘導肝癌細胞S期阻滯及抑制細胞增殖的機制，我們建立了miR-221過表達細胞模型，然后觀察myrothecine

5、A是否可通過miR-221抑制肝癌細胞的增殖。結果顯示，轉染miR-221過表達慢病毒質粒后，SMMC-7721細胞中miR-221的表達明顯增高，相比于對照組，miR-221能明顯促進肝癌細胞增殖。然后，加入1μg/mL myrothecine A后，這種促進作用能明顯被抑制，表明myrothecineA能逆轉miR-221引起的肝癌細胞增殖。為進一步探討其機制，我們用1μg/mL myrothecine A處理miR-221過表達的

6、肝癌細胞株SMMC-7721，24h后，通過實時熒光定量PCR檢測miR-221的表達水平，并用Westem blot檢測miR-221的靶基因p27kip1(下文記作p27)的表達。結果顯示，myrothecine A能顯著抑制miR-221的表達。在肝癌細胞中轉染miR-221過表達慢病毒質粒后，p27的表達水平明顯下降。但加入1μg/mL myrothecine A后，p27的表達水平可明顯增加。以上結果說明，myrothecin

7、e A能通過抑制miR-221的表達而影響p27的表達水平，進而調控肝癌細胞的增殖。
　　其次，我們觀察myrothecine A通過miR-221對DC成熟的影響。在DC成熟過程中，抗原遞呈能力逐漸增強，并高水平表達表面共刺激分子，如CD86、CD40、CD80等，因此，我們首先將未成熟的小鼠DC與miR-221過表達穩(wěn)轉細胞株Hepa1-6（小鼠肝癌細胞株）共培養(yǎng)，用流式細胞術檢測DC表面CD86和CD40分子的表達水平。結果

8、顯示，miR-221過表達能顯著抑制DC表面CD86和CD40的表達，表明miR-221可抑制DC的成熟。接下來，我們在未成熟的小鼠DC與miR-221過表達穩(wěn)轉細胞株Hepa1-6共培養(yǎng)的基礎上，又加入1μg/mL myrothecine A，作用24h后，進行流式細胞術檢測。結果發(fā)現(xiàn)，加入myrothecineA后，DC表面CD86和CD40分子的表達都有不同程度的增加，提示myrothecineA能逆轉miR-221對DC成熟的抑

9、制作用。這些結果表明，myrothecine A能通過miR-221調控肝癌微環(huán)境中DC的成熟。而細胞因子如Arg-1、TGF-β、iNOS、IL-10、IP-10等可抑制免疫細胞的分化、成熟及功能，為探明miR-221抑制DC成熟的機制，我們將miR-221過表達慢病毒質粒感染Hepa1-6后，收集細胞，提取mRNA，實時熒光定量PCR檢測這些細胞因子的表達。結果發(fā)現(xiàn)，只有IP-10的表達明顯增加，提示miR-221可能通過增加IP-