骨痹止痛液對兔膝骨性關節(jié)炎軟骨中TGF-β、IGF-1mRNA表達及組織形態(tài)學的影響.pdf

1、目的：本課題通過RT-PCR檢鍘膝關節(jié)軟骨組織T G F-P、IGF-1基因表達水平、骨組織形態(tài)學變化的影響；免疫組化法檢鍘TGF-P蛋白表達水平的變化來證實骨痹止痛液確切的效果，探討骨痹止痛液防治膝骨性關節(jié)炎的作用機制，為臨床應用骨痹止痛液治療膝骨性關節(jié)炎提供理論依據(jù)。
　　方法：將72只6~8月齡、體童2.5~3kg,雌雄不限的新西蘭大白兔按計算機隨機數(shù)字分為6組，分別為低劑量骨痹止痛液組、中劑量骨痹止痛液組、高劑量骨痹止痛液

2、組、鹽酸氨基葡萄糖組、模型組，每組各12只。參考改良Hulth法建立骨性關節(jié)炎模型，分別給5組造模白兔灌喂低、中、高骨痛止痛液，鹽酸氨基葡萄糖片，生理鹽水，并于第4周、第8周處死各組兔取樣，切取關節(jié)軟骨標本，肉眼觀察形態(tài)學改變和光鏡觀察H E染色的病理切片。釆取RT-PCR檢鍘兔膝關節(jié)軟骨中T G F-P、IGF-1因子的表達；釆用免疫組化法檢測TGF-P蛋白表達水平。所得數(shù)據(jù)釆用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。
　　結果：

3、r>　　1.肉眼觀察：正常膝關節(jié)應表面光滑，色澤透明，無增生。4周后模型組關節(jié)軟骨色澤暗淡無光澤，關節(jié)表面不光滑，部分成米黃色，無明顯缺損，滑膜增厚。骨痹止痛液組及鹽酸氨基葡萄糖片組軟骨透明度較模型組髙，無缺損及骨贅新生物。8周后模型組關節(jié)軟骨變黃，軟骨層面出現(xiàn)不同程度的缺損，軟骨透明度明顯降低，有明顯骨贅形成，軟骨甚至出現(xiàn)糜爛。而骨痹止痛液組及鹽酸氨基葡萄糖片組較前無明顯變化。
　　2.H E染色鏡下觀察：正常軟骨表面由于未受損

4、傷，所以比較平整。在顯微鏡的觀察下，軟骨表面分布有均勻的微孔，微孔通過肉哏看不到，只能在顯微鏡下才能看到微小的微孔；軟骨表面還存在礙膠樣的物質(zhì)’呈白色、球狀，并以點狀分布于軟骨表面；4周模型組軟骨組織在HE染色鏡下觀察：結果發(fā)現(xiàn)軟骨表面的表層細胞變薄，并呈現(xiàn)粗糙的表面；甚至部分軟骨表面的軟骨組織的消失，呈絨毛狀；嚴重的部分軟骨表層脫失，表面出現(xiàn)龜裂樣的裂隙，軟骨深層的膠原纖維被暴露出來。
　　正常軟骨細胞結構清楚，細胞膜完整，輪廓

5、請晰，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，胞外可見縱橫交鍇的膠原纖維，模型組細胞膜榕解，密度分布不均一，存在細胞簇集現(xiàn)象，軟骨細胞排列紊亂，潮線多不完整；骨痹止痛液高、中、低劑量組和鹽酸氨基葡萄糖片組軟骨組織損傷情況好于糢型組，軟骨細胞排列不規(guī)則現(xiàn)象在部分區(qū)域仍可見，但相比模型組明顯少見，各層界限欠清楚，鏡下個別區(qū)域有族集現(xiàn)象，潮線個別不完整。8周模型組表現(xiàn)可見軟骨結構破壞，骨贅形成。各治療組較前無明顯差異。
　　3.RT-PCR檢鍘TGF-P

6、mRNA、IGF-1 mRNA：骨痹止痛液低劑量組與模型組第8周比較，骨痹止痛液低劑量組第8周大白兔軟骨標本中TGF-P mRNA、IGF-1 mRNA表達量明顯升高，骨痹止痛液中、高劑量組及鹽酸氨基葡萄糖片組第8周大白兔軟骨標本中TGF-P mRNA、IGF-1 mRNA表達量顯著升高;與骨痛止痛液低劑量組第8周比較，骨痹止痛液中、高劑量組及鹽酸氨基葡萄糖片組第8周大白兔軟骨標本中TGF-P mRNA、IGF-1 mRNA表達量明顯升

7、高;與鹽酸氨基葡萄糖片組第8周比較，骨痹止痛液中、高劑量組第8周大白兔軟骨標本中T G F-P irKNA、IGF-1 mRNA表達量無明顯差異；與第4周骨痹止痛液低、中、高劑量組及鹽酸氨基葡萄糖片組比較，第8周骨痛止痛液低、中、高劑量組及鹽酸氨基葡萄糖片組大白兔軟骨標本中TGF-P irRNA、IGF-1 irRNA表達量明顯升高。
　　4.免疫組化法檢鍘T G F-P蛋白：與空白組比較，模型組軟骨組織TGF-1P蛋白表達7K平

8、顯著降低，組間差異具有統(tǒng)計學意義,與模型組比較，骨痹止痛液高、中、低劑量可升高軟骨組織TGF-1P蛋白表達水平，且以骨痹止痛液高劑量和鹽酸氨基酸葡萄糖作用顯著。
　　結論：本實驗通過H E染色觀察組織學改變來評估組織學損傷指數(shù)（HI)，結果顯示模型組關節(jié)軟骨表面粗糙，凹凸不平，局部出現(xiàn)龜裂樣改變，嚴童者表層脫失，說明模型組關節(jié)軟骨層發(fā)生變化，證明造模成功；同時PCR檢鍘不同劑量的骨痹止痛液對兔膝骨性關節(jié)炎不同時期的軟骨細胞中TGF

9、-P、IGF-1因子表達，各治療組關節(jié)軟骨因子T G F-P、IGF-1表達較模型組顯著升高，說明骨痹止痛液對實驗性兔膝骨性關節(jié)炎具有治療作用，長期服用可以抑制關節(jié)軟骨的退變。鹽酸氨基葡萄糖片同樣表現(xiàn)出對細胞因子（TGF-自、I G F-1)的促進作用，且與骨痹止痛液高中劑量組在數(shù)據(jù)統(tǒng)計上顯示無差異性，而且骨痹止痛液髙、中、低劑量可升髙軟骨組織TGF-1P蛋白表達水平，可以認為骨痹止痛液在膝骨性關節(jié)炎的防治上有相對優(yōu)勢有必要進一步開展基