SOX3通過(guò)Wnt-β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究.pdf

1、在全世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤中，食管癌(esophageal carcinoma，EC)的發(fā)病率居第8位，死亡率居第6位。2008年，全球約有482，300人罹患EC，406，800人死于EC。由于大部分EC病人就診時(shí)已屬于局部晚期或已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此EC病人的5年生存率僅為19％。EC分為兩種主要的病理類型，即食管鱗癌(esophageal squamouscell carcinoma，ESCC)和食管腺癌(esophageal ade

2、nocarcinoma，EAC)，兩者的地理分布和好發(fā)部位有著顯著差異:腺癌常見(jiàn)于西方國(guó)家，好發(fā)于下段食管和胃食管交界部;而ESCC常見(jiàn)于亞洲國(guó)家，尤其是中國(guó)和伊朗，多見(jiàn)于中、上段食管。中國(guó)是EC高發(fā)地區(qū)，占全球EC總數(shù)的一半以上(2008年約有259，235例新發(fā)病例)，其中90％以上是ESCC。早期診斷是提高ESCC病人預(yù)后的關(guān)鍵，但由于缺乏有效的特異性腫瘤標(biāo)志物和預(yù)后因子，目前尚難以對(duì)ESCC進(jìn)行早期診斷和預(yù)后評(píng)估。
　　S

3、OX(Sry-like HMG box)蛋白家族屬于HMGb(high-mobility group box)蛋白超家族，是一種DNA結(jié)合蛋白。SOX在不同的物種間高度保守，參與多種生理發(fā)育過(guò)程，包括:神經(jīng)發(fā)生、軟骨形成和睪丸發(fā)育等。人SOX3是SOXB1亞組中的一員，定位于染色體Xq27.1，是一種轉(zhuǎn)錄因子。在發(fā)育過(guò)程中SOX3表達(dá)逐漸降低，使細(xì)胞由增殖型轉(zhuǎn)變?yōu)榉只?。在體外實(shí)驗(yàn)中，SOX3外源性表達(dá)增高可誘導(dǎo)雞胚成纖維細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞

4、轉(zhuǎn)化。此外，已證實(shí)SOX3是一種原癌基因，其含有逆轉(zhuǎn)錄病毒插入位點(diǎn)，與逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA結(jié)合后，可導(dǎo)致淋巴瘤。近期的研究表明，小細(xì)胞肺癌病人的血清中SOX3自身抗體濃度明顯增高。以上結(jié)果提示SOX3可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。
　　Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是目前公認(rèn)的腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要機(jī)制。在穩(wěn)定狀態(tài)下，當(dāng)Wnt信號(hào)缺失時(shí)，胞漿內(nèi)的β-catenin被糖原合成酶激酶(glycogen synthasekinase3

5、β，GSK3β)磷酸化，使β-catenin發(fā)生降解，并維持其在胞漿內(nèi)的低濃度。Wnt/β-catenin通路激活的具體過(guò)程為:1.由細(xì)胞分泌的Wnt蛋白同時(shí)與細(xì)胞表面的Fzd跨膜受體和共受體LRP5/6結(jié)合，共同形成Wnt受體復(fù)合物，這是Wnt信號(hào)通路激活的重要起始步驟。2.在胞漿內(nèi)，Wnt受體復(fù)合物抑制GSK3β/APC/Axin/CK1α復(fù)合物中的關(guān)鍵成分GSK3β的活性，阻止GSK3β對(duì)β-catenin的磷酸化作用，使β-ca

6、tenin的降解減少，導(dǎo)致β-catenin在胞漿內(nèi)逐漸聚積。3.當(dāng)胞漿中β-catenin達(dá)到一定濃度時(shí)就向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，轉(zhuǎn)入胞核后，β-catenin與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF相互作用，調(diào)節(jié)靶基因cyclinDl、c-myc和c-jun等的表達(dá)，從而發(fā)生促癌作用。目前已在多種人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)β-catenin發(fā)生突變或調(diào)控障礙，如結(jié)直腸癌、腎癌、乳腺癌、胰腺癌、肝細(xì)胞癌等。近期的研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin途徑還可能與腫瘤干

7、細(xì)胞性的維持以及腫瘤耐藥有著密切的關(guān)系。
　　目前對(duì)SOX3在ESCC中的研究鮮有報(bào)道，對(duì)SOX3在ESCC中的作用機(jī)制尚不清楚。有必要進(jìn)一步明確SOX3表達(dá)與ESCC病人臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，深入研究SOX3表達(dá)改變對(duì)ESCC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的相互作用關(guān)系，并探索SOX3在ESCC發(fā)生、發(fā)展中的作用和機(jī)制。
　　目的:
　　本研究首次以ESCC組織和細(xì)胞作為研究對(duì)象，觀

8、察SOX3表達(dá)改變與ESCC病人臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，以及對(duì)ESCC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，明確ESCC中SOX3與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的相互作用關(guān)系。初步揭示SOX3在ESCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用和機(jī)制，為ESCC的早期診斷和預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.收集臨床病理資料和組織學(xué)標(biāo)本，采用RT-PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)SOX3在ESCC及其對(duì)應(yīng)遠(yuǎn)癌非腫瘤食管黏膜上皮

9、(non-neoplastic esophagealepithelium，NE)組織中的表達(dá)，分析SOX3表達(dá)與ESCC病人臨床病理特征之間的關(guān)系。并對(duì)ESCC術(shù)后病人進(jìn)行隨訪，進(jìn)一步研究SOX3表達(dá)與ESCC病人預(yù)后的關(guān)系。
　　2.篩選出SOX3高表達(dá)的ESCC細(xì)胞株，并構(gòu)建SOX3 siRNA表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染SOX3高表達(dá)的ESCC細(xì)胞，建立穩(wěn)定抑制SOX3表達(dá)ESCC細(xì)胞株。通過(guò)MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transw

10、ell小室侵襲實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測(cè)等體外實(shí)驗(yàn)觀察SOX3表達(dá)抑制對(duì)ESCC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡功能的影響。
　　3.采用Western blot檢測(cè)SOX3抑制后ESCC細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵因子p-GSK3βser9、β-catenin、TCF4、c-myc和cyclin D1蛋白的表達(dá)，并使用Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活劑LiCl處理ESCC細(xì)胞，采用MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和T

11、ranswell小室侵襲實(shí)驗(yàn)觀察SOX3通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)ESCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力的調(diào)控作用。
　　結(jié)果:
　　1.RT-PCR、Western blot和免疫組化實(shí)驗(yàn)表明，SOX3 mRNA和蛋白在ESCC組織中的表達(dá)明顯高于其在對(duì)應(yīng)遠(yuǎn)癌NE組織中的表達(dá)。
　　2.免疫組化實(shí)驗(yàn)表明，SOX3表達(dá)增高與腫瘤區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N分期）和TNM分期進(jìn)展顯著相關(guān)。SOX3表達(dá)增高的ESCC病人的

12、無(wú)病生存率(recurrence-free survival，RFS)和總體生存率(overall survival，OS)均明顯降低，且是ESCC病人的獨(dú)立預(yù)后因子。
　　3.成功篩選出SOX3高表達(dá)的ESCC細(xì)胞株(TE-10細(xì)胞)。構(gòu)建了SOX3 siRNA表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染TE-10細(xì)胞，成功建立了穩(wěn)定抑制SOX3的ESCC細(xì)胞株(siSOX3TE-10細(xì)胞株)。
　　4.MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwe

13、ll小室侵襲實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測(cè)表明，SOX3表達(dá)降低對(duì)ESCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力起抑制作用，而對(duì)ESCC細(xì)胞凋亡起促進(jìn)作用。
　　5.Western blot實(shí)驗(yàn)表明，SOX3抑制后Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵因子p-GSK3βser9、β-catenin、TCF4、c-myc和cyclin D1蛋白表達(dá)降低。使用Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活劑LiCl處理ESCC細(xì)胞，采用MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃

14、痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)證明，SOX3可通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)ESCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。
　　結(jié)論:
　　1.SOX3在ESCC中表達(dá)增高。
　　2.SOX3表達(dá)增高與ESCC區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N分期）和TNM分期進(jìn)展有關(guān)。SOX3表達(dá)增高的ESCC病人的RFS和OS均明顯降低，且是ESCC病人的獨(dú)立預(yù)后因子。
　　3.SOX3通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)