Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的研制及其在流感病毒培養(yǎng)中的應(yīng)用.pdf

1、流行性感冒是人類至今不能有效控制的傳染病之一，每次流行都給人類的健康和經(jīng)濟(jì)造成重大的損失。雖然有抗病毒藥物，但可能誘導(dǎo)耐藥株出現(xiàn)，不適合大范圍長(zhǎng)時(shí)間來應(yīng)對(duì)流行性感冒。目前接種疫苗仍被認(rèn)為是預(yù)防流感的最好方法。傳統(tǒng)的流感疫苗以雞胚為培養(yǎng)基質(zhì)，生產(chǎn)過程容易受到微生物的污染、不能大規(guī)模生產(chǎn)、對(duì)流感大流行應(yīng)急能力差等，因此基于動(dòng)物細(xì)胞為基質(zhì)生產(chǎn)的流感疫苗成為疫苗發(fā)展的重要方向。非洲綠猴腎細(xì)胞系Vero是世界衛(wèi)生組織WHO推薦的人用疫苗生產(chǎn)基質(zhì)，

2、目前已用于多種疫苗的生產(chǎn)，其安全性已得到認(rèn)證。在流感大流行時(shí)，如何提高細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)水平以提高流感疫苗的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率及病毒的培養(yǎng)條件成為動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)及疫苗生產(chǎn)的目標(biāo)和競(jìng)爭(zhēng)核心。動(dòng)物細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的開發(fā)，將實(shí)現(xiàn)流感疫苗高效率、低成本的生產(chǎn)，成為流感疫苗開發(fā)的重要環(huán)節(jié)。因此，本文借助統(tǒng)計(jì)學(xué)方法開發(fā)適用于Vero細(xì)胞生長(zhǎng)的無血清培養(yǎng)基。
　　首先，本文通過連續(xù)運(yùn)用單因素實(shí)驗(yàn)—Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)—最陡爬坡實(shí)驗(yàn)—中心

3、組合實(shí)驗(yàn)5種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，建立了Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)基快速高效的開發(fā)技術(shù)。通過單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、高密度脂蛋白、牛血清白蛋白、表皮生長(zhǎng)因子、透明質(zhì)酸和亞硒酸鈉在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的添加濃度，考察的濃度范圍分別為胰島素3-6ug/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白7.5-15ug/mL、高密度脂蛋白10-20ug/mL、牛血清白蛋白2-4mg/mL、表皮生長(zhǎng)因子50-100ng/mL、透明質(zhì)酸15-30mg/mL、亞硒酸鈉4-8mmol/mL;進(jìn)一

4、步通過Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)考察胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、高密度脂蛋白、牛血清白蛋白、表皮生長(zhǎng)因子、透明質(zhì)酸和亞硒酸鈉7種添加物對(duì)Vero細(xì)胞生長(zhǎng)的影響作用大小，方差分析結(jié)果表明胰島素、牛血清白蛋白對(duì)Vero細(xì)胞的生長(zhǎng)有顯著正影響作用(p＜0.05)，轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長(zhǎng)因子、透明質(zhì)酸有正影響作用(p＞0.05)，而高密度脂蛋白和亞硒酸鈉對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)存在負(fù)影響作用;又通過最陡爬坡實(shí)驗(yàn)拓寬胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白的濃度范圍，3種添加

5、物的濃度分別為5.4ug/mL，13.8ug/mL，3.6mg/mL時(shí)，測(cè)定的OD490值最大;最后通過中心組合實(shí)驗(yàn)確定胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白的最佳濃度條件，分別為胰島素5.625ug/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白14.034ug/mL，牛血清白蛋白3.92mg/mL，按此條件配制的無血清培養(yǎng)基可支持Vero細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)。
　　隨后，利用Vero細(xì)胞無血清培養(yǎng)培養(yǎng)體系，對(duì)Vero細(xì)胞培養(yǎng)H5N1流感病毒過程的MOI及TPCK-胰蛋白酶

6、的添加量進(jìn)行優(yōu)化，自配無血清培養(yǎng)體系培養(yǎng)H5N1流感病毒的條件為:接種量MOI為0.001，TPCK-胰蛋白酶的添加量1ug/mE，并且每隔24h補(bǔ)加初始濃度的TPCK-胰蛋白酶。在優(yōu)化的H5N1流感病毒生產(chǎn)條件下，自配無血清培養(yǎng)基和Gibco商品化無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)H5N1流感病毒的的HA及感染性滴度沒有顯著性差別，但都低于完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基、自配無血清培養(yǎng)基和Gibco商品化無血清培養(yǎng)基三種培養(yǎng)基培養(yǎng)出的病毒HA滴度分別為:5