JAK2特異性抑制劑AG490對實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型的Th17-Treg細胞平衡的影響.pdf

1、目的:探討JAK2抑制劑對Th17/Treg平衡的影響和對MS的治療效果。
　　方法:
　　將60只體重在18-22g之間的6-8周齡C57BL/6雌性小鼠隨機分組為:EAE模型組、AG490干預組和空白對照組。本實驗采用以200μl磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解300μg人工合成MOG35-55多肽，再與等量含有4 mg/ml卡介苗的完全福氏佐劑(CFA)充分混合成為油包水乳劑，制備完全抗原將完全抗原皮下注射于雙側側腹壁4點位

2、置。EAE模型組和AG490干預組均于免疫后第0h和48 h于腹腔內注射百日咳毒素500 ng，免疫C57BL/6小鼠制備EAE模型。直接將200μl PBS與等量CFA乳化免疫空白對照組動物。于免疫后第3、5、7、9、11、13、15、17、19天給予AG4901mg皮下注射AG490干預組小鼠至處死，每天給予生理鹽水0.1ml/d空白對照組和EAE模型組小鼠皮下注射。觀察藥物對動物臨床表現(xiàn)的影響，免疫后第13天每組隨機處死小鼠并取材

3、，標記為發(fā)病前組，并在約為免疫后第20天記為高峰組每組隨機處死小鼠并取材。將各實驗組小鼠按不同時期處死后取脊髓組織進行HE染色觀察炎癥細胞浸潤情況，同時進行免疫組織化學染色，觀察IL-17、Foxp3+、p-STAT5陽性細胞的分布并計數，進行比較。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析計量資料以均數±標準差（(x)±S）表示，若數據不滿足正態(tài)性(P＜0.05)則進行秩轉換，多組計量資料均數的比較應用ANOVA方差分析，組間兩兩比較采

4、用SNK法，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1、組織病理學觀察
　　(1)空白對照組脊髓組織免疫后13天及免疫后20天均未觀察到“血管袖套”現(xiàn)象，且淋巴細胞浸潤稀疏。
　　(2)免疫后13天AG490干預組脊髓組織內淋巴細胞多于空白對照組，“血管袖套”不明顯，但EAE組脊髓組織內淋巴細胞數量較AG490干預組數量多，且“血管袖套”更明顯。
　　(3)免疫后20天時EAE組及AG490干預組較

5、免疫13天時EAE組及AG490干預組淋巴細胞較多，且EAE組淋巴細胞浸潤較AG490干預組更為明顯。
　　2、免疫組化染色結果觀察
　　2.1
　　(1) IL-17是由CD4+Th17細胞分泌的細胞因子，與MS的發(fā)生密切相關。主要見于胞漿表達。
　　(2) Foxp3是維持CD4+CD25+Treg細胞功能的轉錄因子，且對于Treg細胞來說具有特異性，CD4+CD25+Treg細胞具有維持免疫平衡的作用，可一

6、定程度上緩解MS的發(fā)展。主要見于胞漿表達。
　　(3) STAT5為STATs家族蛋白一員，JAK2-STAT5通路參與CD4+CD25+Treg細胞的活化，p-STAT5為磷酸化后的STAT5。在胞漿和胞核中都可以觀察到p-STAT5的陽性細胞。
　　2.2陽性細胞數觀察
　　2.2.1免疫后13天
　　(1) IL-17 EAE組IL-17陽性細胞數（44.89±10.43）多于AG490干預組（16.00±

7、6.80）且具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），同時兩組IL-17陽性細胞數多于空白對照組（8.22±3.00）且差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(2) Foxp3 EAE組Foxp3陽性細胞數（32.67±11.12）少于AG490干預組（61.00±11.54）且具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，同時兩組Foxp3陽性細胞數多于空白對照組（7.56±3.68）且差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(3) p-S

8、TAT5 EAE組p-STAT5陽性細胞數（28.56±12.80）少于AG490干預組（64.89±23.28）且具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，同時兩組p-STAT5陽性細胞數多于空白對照組（11.22±6.10）且差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.2.2免疫后20天
　　(1) IL-17 EAE組IL-17陽性細胞數(57.33±13.36)多于AG490干預組（20.56±5.45）且具有統(tǒng)計學意義(P

9、＜0.05)，同時兩組IL-17陽性細胞數多于空白對照組（6.3±3.67）且差別具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　(2) Foxp3 EAE組Foxp3陽性細胞數（22.67±6.89）少于AG490干預組（50.11±9.70）且具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，同時兩組Foxp3陽性細胞數多于空白對照組（6.33±3.24）且差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(3)p-STAT5 EAE組p-STAT5陽性細

10、胞數（17.56±7.84）少于AG490干預組（43.44±8.14）且具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，同時兩組p-STAT5陽性細胞數多于空白對照組（8.78±2.11）且差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.2.3免疫后13天與免疫后20天對比
　　(1) IL-17免疫13天時EAE組IL-17陽性細胞數(44.89±10.43)少于免疫后20天EAE組IL-17陽性細胞數（57.33±13.36）且差別具有

11、統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。免疫13天時AG490干預組(16.00±6.80)與免疫后20天AG490干預組（20.56±5.45）IL-17陽性細胞數相比差別不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。兩時期空白對照組IL-17陽性細胞數差別不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　(2) Foxp3免疫13天時EAE組Foxp3陽性細胞數（32.67±11.12）多于免疫后20天EAE組Foxp3陽性細胞數（22.67±6.89）且差別

12、具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。免疫13天時AG490干預組Foxp3陽性細胞數（61.00±11.54）多于免疫后20天AG490干預組（50.11±9.70）。兩時期空白對照組Foxp3陽性細胞數差別不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　(3)p-STAT5免疫13天時EAE組p-STAT5陽性細胞數（28.56±12.80）多于免疫后20天EAE組p-STAT5陽性細胞數(17.56±7.84)且差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0