microRNA-146a和microRNA-155在吸入性肺損傷中的功能研究.pdf

1、據統(tǒng)計，吸入性肺損傷可使燒傷病人的整體死亡率增加20％以上。雖然隨著科學的發(fā)展，燒傷的整體救治水平有了很大的進步，但對吸入性肺損傷而言，目前國內外臨床救治仍停留在被動的對癥治療水平，如開放氣道（氣管切開），吸氧，機械通氣等;國內外對吸入性肺損傷發(fā)展的實驗研究主要有以下兩方面:1、藥物治療機制;2、細胞修復機制，尚缺乏主動的特異性治療方法，表明我們至今對吸入性肺損傷的認識還較為膚淺，究其原因是對其發(fā)病及病理變化機制還未真正闡明。因此，研究

2、吸入性肺損傷的確切發(fā)病機制及有效的干預措施實屬必要。
　　臨床研究和動物實驗表明:炎性細胞浸潤、大量自由基生成、促炎癥介質在肺組織過度表達以及炎癥信號通路的激活是吸入肺損傷的早期重要的致病機制，Nuclear factorκB(NF-κB)信號通路是其中最為關鍵的一條，其通過多種途徑介導吸入性肺損傷的病理生理過程。因此，抑制NF-κB信號通路的活化對于阻斷吸入肺損傷的致病機制、從而減輕其臨床癥狀、逆轉其病理生理過程具有積極的意義。

3、本實驗組前期已證實NF-κ出信號通路中有多個微小RNA(microRNAs，miRNAs)啟動子結合位點，應用miRNAs靶點定向調控炎癥因子為臨床治療吸入性肺損傷開辟了新途徑。
　　MiRNAs是RNA家族成員之一，真核細胞中一類由內源性非蛋白編碼的單鏈小分子RNA，長度約18-25個核苷酸，參與轉錄后的基因調控。miRNA來源于初級轉錄產物（pri-miRNA），在細胞核內經核糖核酸內切酶Ⅲ(Drosha)進行第一步剪切后，形

4、成長度約60-80個堿基的含發(fā)卡結構的前體miRNA(pre-miRNA)。然后通過依賴Exportin-5的轉運機制，將pre-miRNA轉運至細胞質內，隨后在另一類核糖核酸內切酶Ⅲ(Dicer)的第二次剪切作用下，加工形成約為18-25個堿基長度的成熟miRNA。miRNA與靶mRNA3'-非翻譯區(qū)結合在轉錄后降解，或者與之部分結合在翻譯水平抑制蛋白合成，從而通過調節(jié)基因表達，在細胞增殖、分化、代謝、凋亡、胚胎發(fā)育、病毒感染、腫瘤發(fā)

5、生以及免疫應答等多種生物學過程中起著至關重要的作用。細胞接收外源或內源壓力信號后的一種早期反應表現(xiàn)為miRNAs的表達，參與調控機體免疫應答。但目前關于miRNAs在吸入性肺損傷的作用還鮮有報道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在H．pylori感染胃上皮細胞模型中表明了miR-146a和miR-155基因的啟動子序列中含有NF-κB結合位點，證實了炎癥感染誘導miR-146a和miR-155的高表達受到NF-κB信號通路調節(jié)。因此，我們根據前期實

6、驗，在吸入性肺損傷模型中，尋找miR-146a和miR-155新的靶基因，并驗證其在吸入性肺損傷中的作用機制。
　　方法：
　　MiR-146a、miR-155在煙霧刺激吸入性肺損傷中的功能研究。
　　1、靶基因的預測:根據生物信息學TargetScan、Miranda、PicTar三大靶標分析軟件預測miR-146a、miR-155靶基因，通過查閱文獻并結合靶基因功能篩選與NF-κB炎性關系更貼近的基因。
　　

7、2、熒光素酶實驗:鑒定miR-146a、miR-155分別與靶基因結合作用。
　　3、Real-time PCR實驗:
　　細胞模型:
　?、贆z測轉染miR-146a、miR-155在A549細胞中靶基因的RNA的表達
　?、跈z測煙霧顆粒刺激轉染miR-146a、miR-155 A549細胞中靶基因及炎癥因子RNA的表達。
　　動物模型:
　　檢測煙霧刺激小鼠轉染miR-146a、miR-155肺組織

8、中靶基因及炎癥因子RNA的表達。
　　4、Western blot實驗:檢測細胞模型、動物模型靶基因蛋白、環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表達。
　　5、ELISA實驗:檢測細胞模型、動物模型炎癥因子白細胞介素8（interleukin-8，IL-8）、生長相關癌基因α(Growth-related oncogene-α，GRO-α)、單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic

9、 peptide-1，MCP-1）、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）的表達。
　　本研究結果表明:
　　1、miR-146a和miR-155靶基因的預測及鑒定。
　?、倮肨argetScan、Miranda、PicTar三大靶標分析軟件預測到miR-146a的靶基因:Fas相關因子2(Fas associated f

10、actor2，F(xiàn)AF-2)、Notch2; miR-155的靶基因:髓樣分化因子88(myeloid differentiationfactor88，MyD88)。
　?、跇嫿ê凶饔冒悬c的熒光素酶報告載體，證實了miR-146a和miR-155能與靶基因的3'-UTR結合;實時定量PCR結果表明，miR-146a可通過降解FAF-2、Notch-2的mRNA的表達，miR-155可抑制MyD88的mRNA表達。
　　2、m

11、iR-146a和miR-155在吸入性肺損傷中功能鑒定
　　通過細胞、動物實驗過表達miR-146a、miR-155后，利用實時定量PCR和Western blot證實了miR-146a和miR-155能與靶基因的3'-UTR結合，能夠減少煙霧刺激吸入性肺損傷引起的炎癥反應關鍵酶COX-2和炎癥因子IL-8、GRO-α、MCP-1、TNF-α、IL-1β的表達(P＜0.05)，證明miR-146a和miR-155在吸入性肺損傷炎癥

12、反應中起到調控作用。
　　結論:
　　1、預測并驗證了miR-146a和miR-155在小鼠肺上皮細胞中的一小部分靶基因，表明miR-146a和miR-155通過作用于FAF-2、Notch-2、MyD88等在信號轉導、炎癥反應等過程中發(fā)揮重要作用的關鍵蛋白，參與調控吸入性肺損傷引起的炎癥反應。
　　2、miR-146a和miR-155作為一類新的負反饋調節(jié)因子，與其靶基因構成全新的基因網絡調控，參與吸入性肺損傷中炎癥