靶向抑制EGFR信號通路治療骨巨細胞瘤的機制研究.pdf

1、骨巨細胞瘤（Giant cell tumor of bone，簡稱GCTB）是一種具有侵襲性呈膨脹性生長，并且以溶骨性破壞為主要特點的良性骨腫瘤，大約占所有原發(fā)骨腫瘤的5％左右。骨巨細胞瘤主要有三種細胞成分構成:破骨細胞樣多核巨細胞，單核梭狀基質細胞和圓形的單核細胞或巨噬細胞來源的單核細胞。骨巨細胞瘤的發(fā)病和復發(fā)機制至今仍不清楚，由于少部分骨巨細胞瘤有惡變或轉移的潛能，其生物學行為及預后目前難以預測。研究表明基質細胞能吸引和促進單核-巨

2、噬細胞分化形成多核巨細胞，因此目前多認為基質細胞是致瘤的重要因素。骨巨細胞瘤的治療當前仍以手術治療為主，手術切除的方式主要包括:瘤內刮除術、外科邊緣病灶切除術以及En-bloc整塊切除術。盡管完整的手術切除腫瘤聯(lián)合雙膦酸鹽的輔助治療能明顯降低骨巨細胞瘤的局部復發(fā)率，但目前報道的27％-65％的局部復發(fā)率仍不容樂觀。除去手術治療，骨巨細胞瘤對化療放療均不敏感，這使得當腫瘤因為解剖位置、遠處轉移、累及多個節(jié)段以及功能要求，難以獲得滿意的切除

3、時，缺乏行之有效的輔助治療手段。目前主要的藥物治療有雙膦酸鹽和狄諾塞麥，兩者均以抑制破骨細胞樣多核巨細胞引起的的骨吸收來發(fā)揮治療作用。對于致瘤的基質細胞，兩者均無直接或間接的作用，因而這些治療很難避免腫瘤局部的再次復發(fā)。此外，骨巨細胞瘤多伴有豐富的血供和大量的血管新生，臨床上約有10-14％的骨巨細胞瘤伴有動脈瘤樣骨囊腫的形成。因此若能找到同時抑制多核巨細胞的分化形成和基質細胞瘤的增殖，并能抑制血管新生的全新治療方法，將能更加有效地控制

4、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)和轉移。
　　EGFR是一個170kDa的具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，為erbB(HER)家族成員，又稱為erbB1/HER1，主要由胞外配體結合結構域（ECD，621個氨基酸）、跨膜親脂結構域（TM，23個氨基酸）、胞內激酶結構域（542個氨基酸）構成。受體EGFR識別并結合胞外配體后，發(fā)生二聚化和磷酸化，并激活下游的Ras-MAPK信號通路、PI3K-AKT-mTOR信號通路、Src-JAK-STAT

5、s信號通路和PLCγ-PKC信號通路，調節(jié)細胞的周期進程、增殖、凋亡、遷移等活動。EGFR過表達、突變或過度激活將持續(xù)激活下游信號通路，引起細胞異常增殖，血管新生和發(fā)生轉移，導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有相關文獻研究表明EGFR信號通路在GCTB疾病的發(fā)生發(fā)展中起著舉足輕重的作用，其在基質細胞的增殖，破骨細胞的形成上可能起著重要的調控作用。這提示著EGFR信號通路是一個潛在的極具價值的骨巨細胞瘤治療靶點。
　　目的:
　?。ㄒ唬?/p>

6、比GCTB腫瘤細胞與正常人間充質干細胞以及GCTB腫瘤標本與正常人松質骨中EGFR信號通路中重要的磷酸化蛋白表達差異。
　　（二）觀察特異性阻斷EGFR信號通路對于GCTB多核巨細胞的形成、分化的影響。
　?。ㄈ┯^察特異性阻斷EGFR信號通路對于GCTB基質細胞增殖或凋亡的影響。
　?。ㄋ模┯^察特異性阻斷EGFR信號通路對GCTB條件培養(yǎng)基誘導的破骨細胞的形成的影響;探索GCTB基質細胞調控破骨細胞成熟的機制和EGF

7、R信號通路調控破骨細胞分化形成的時間窗。
　　（五）觀察特異性阻斷EGFR信號通路對人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)增殖、遷移以及對GCTB基質細胞條件培養(yǎng)基誘導的血管新生的影響。
　　（六）利用動物模型觀察特異性阻斷EGFR信號通路在體內對GCTB治療的效果。
　　方法:
　?。ㄒ唬玫鞍踪|免疫印跡實驗和免疫組織化學實驗對比GCTB腫瘤細胞與正常人間充質干細胞以及GCTB腫瘤標本與正常人松質骨中EGFR信號通

8、路中重要的磷酸化蛋白表達差異。
　　（二）應用TRAP染色實驗、PCR實驗以及骨片實驗觀察使用酪氨酸激酶抑制劑靶向阻斷EGFR信號通路后對GCTB多核巨細胞的形成及分化的影響。
　　（三）應用熒光染色實驗觀察特異性阻斷EGFR信號通路對GCTB基質細胞增殖的影響，流式細胞實驗觀察其對基質細胞凋亡的影響。
　　（四）應用TRAP染色實驗及PCR實驗明確特異性阻斷EGFR信號通路對GCTB條件培養(yǎng)基誘導的破骨細胞的形成、分

9、化的影響及機制。
　?。ㄎ澹眉毎鲋硨嶒灐⒌鞍踪|免疫印跡實驗、Transwell實驗、血管新生實驗觀察EGFR信號通路在HUVECs增殖、遷移以及對GCTB基質細胞條件培養(yǎng)基誘導的血管新生的影響作用。
　?。┩ㄟ^脛骨原位注射荷瘤構建GCTB小鼠動物模型，給予酪氨酸激酶抑制劑Gefitinib靶向抑制EGFR信號通路，觀察其在體內對GCTB溶骨破壞的治療效果;通過雞胚絨毛尿囊膜荷瘤模型，觀察不同濃度Gefitinib靶

10、向抑制EGFR信號通路后成瘤的效果。
　　結果:
　?。ㄒ唬〨CTB腫瘤標本及原代細胞中EGFR信號通路異常激活。
　　（二）我們利用酪氨酸激酶抑制劑靶向阻斷EGFR信號通路后，GCTB多核巨細胞形成以及分化受到明顯抑制，其導致的局部溶骨破壞也被有效抑制，并呈藥物劑量依賴性;隨著藥物濃度上升RANKL的表達減弱，而OPG的表達增強。
　?。ㄈ┨禺愋宰钄郋GFR信號通路能有效抑制GCTB基質細胞的增殖，但對基質細

11、胞的凋亡無明顯影響。
　　（四）特異性阻斷EGFR信號通路能有效抑制GCTB條件培養(yǎng)基誘導的破骨細胞的形成;EGFR信號通路主要在破骨細胞形成的早期階段起調控作用;基質細胞的EGFR信號通路被阻斷后，其分泌的細胞因子:NFATc1、TRAP、MMP9、M-CSF、MCP-1、SDF-1表達水平明顯下降。
　?。ㄎ澹┳钄郋GFR信號通路能有效抑制HUVECs的增殖、遷移以及基質細胞條件培養(yǎng)基誘導的血管新生。
　?。┞?/p>

12、鼠體內實驗結果顯示:阻斷EGFR信號通路能有效地抑制GCTB局部的溶骨破壞，Gefitinib在裸鼠體內無明顯毒副作用;雞胚絨毛尿膜囊荷瘤實驗顯示:當Gefitinib濃度達到10μM，雞胚絨毛尿囊膜上無法成瘤。
　　結論:
　　本研究中我們通過蛋白質免疫印跡實驗和免疫組化實驗證實了EGFR信號通路在GCTB中呈異常高表達狀態(tài)。通過應用EGFR小分子化合物抑制劑靶向阻斷EGFR信號通路，觀察到破骨細胞樣多核巨細胞的形成以及基

13、質細胞的增殖和對單核細胞的趨化募集作用受到明顯抑制;由基質細胞誘導的人血管內皮細胞的遷移及血管新生也得到有效地控制;在小鼠動物模型體內實驗中，抑制EGFR能有效阻止腫瘤對骨結構的溶骨破壞，且無明顯毒副作用;雞胚絨毛尿膜囊荷瘤實驗顯示，抑制EGFR信號通路能阻止GCTB的成瘤和血管新生。這一研究結果提示著EGFR信號通路在GCTB的發(fā)生發(fā)展中起到重要的調控作用。目前EGFR靶向抑制劑已在多種惡性腫瘤的臨床治療中得到應用，我們期待在不久的將