基于酶催化沉積的單堿基突變檢測及免疫分析.pdf

1、人類的許多遺傳性疾病都是由于基因的變異引起的，其中尤以單堿基的突變，即單堿基多態(tài)性最為普遍。實現(xiàn)對這些基因單堿基突變的早期、準確、簡便、快速的確認，對于人類相關疾病的發(fā)病機理研究及早期治療具有非常重要的意義。目前，有關單堿基突變的檢測方法已有許多報道。而這些傳統(tǒng)的方法普遍操作繁瑣費時、不易定量、儀器昂貴、而且對工作人員要求較高的專業(yè)技能，因此僅能在少數(shù)實驗室應用。開發(fā)一些簡便、廉價、精確且易于臨床推廣的方法是一件很有價值的工作。此外，由

2、于電化學生物傳感器具有制造簡單、靈敏度高、價格低廉而被廣泛研究，并已在生物檢測中逐步得到了應用。 本文分別研究了運用DNA連接酶、鏈親和素堿性磷酸酶來檢測基因的單堿基突變、基因分型及人免疫球蛋白?，F(xiàn)將所作的工作簡單的敘述一下： 第一部分：結合了DNA連接酶的高忠實性以及鏈親和素堿性磷酸酶的催化作用對K-Ras癌基因的單堿基突變進行定性及定量分析。金電極表面固定的探針和待檢測的突變鏈是互補的，在連接酶、突變目標鏈以及5’-

3、磷酸化的連接探針存在下，表面固定的探針會和連接探針連接起來。在90℃下進行熱處理變性。接著，生物素化的檢測探針和連接產物進行互補配對反應。再接著加入鏈親和素化的堿性磷酸酶，通過生物素和鏈親和素的特異性識別作用，鏈親和素化的堿性磷酸酶結合到了電極表面。在堿性磷酸酶的作用下，非還原性的抗壞血酸2-磷酸(AA-P)轉化成抗壞血酸(AA)。溶液中的銀離子在抗壞血酸的作用下，被還原成銀，從而使得銀顆粒沉積在電極表面。線性掃描伏安法被用來檢測電極表

4、面沉積的銀。這種方法已經成功的用于檢測編碼K-Ras癌基因的第12位密碼子的單堿基突變，其檢測下限為80 fM。 第二部分：基于第一部分的原理，結合DNA連接酶和堿性磷酸酶，測定多藥耐藥基因MDRl的基因分型。多藥耐藥基因MDR1的基因分型有3種，分別為C-C型、C-T型和T-T型。對基因分型的檢測是在兩個金電極上進行的，這兩個金電極分別通過自組裝巰基DNA而固定上探針DNA，接著加入待測的目標鏈，如果目標鏈和探針DNA互相匹配

5、，則能產生響應。反之，則不能。通過兩個電極的最終反應結果，我們可以得知具體的基因分型。 第三部分：發(fā)展了一種生物沉積銅并以鉑催化氫還原伏安法進行檢測的高靈敏電化學免疫分析新方法。該方法采用夾心免疫分析模式，實現(xiàn)了人免疫球蛋白(H IgG)的測定。首先在聚苯乙烯微孔板中固定羊抗H IgG捕獲抗體，H IgG捕獲后，堿性磷酸酶標記的H IgG抗體通過與H IgG形成夾心復合物而結合在微孔板上。結合的堿性磷酸酶催化抗壞血酸磷酸酯底物水