SIRT1在糖尿病腎病足細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　糖尿病腎病是導(dǎo)致終末期腎病的最主要病因，超40％的腎臟替代治療患者是由糖尿病引起。臨床主要表現(xiàn)為大量蛋白尿。研究認(rèn)為蛋白尿的產(chǎn)生與腎小球足細(xì)胞損傷密切相關(guān)。在糖尿病腎病中，有多種因素如高血糖、血管緊張素Ⅱ(Ang-Ⅱ)等導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡。嚴(yán)格控制血糖及應(yīng)用腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)阻斷劑能夠明顯減少尿蛋白的產(chǎn)生。
　　SIRT1是一種沉默信息調(diào)節(jié)因子，具有NAD+依賴(lài)的去乙酰化酶活性，參與了多種疾病的

2、發(fā)病過(guò)程，其中也包括糖尿病腎病。在糖尿病腎病中，SIRT1參與了炎癥、細(xì)胞凋亡、纖維化等多個(gè)病理過(guò)程。在細(xì)胞凋亡方面，既往研究發(fā)現(xiàn)，高糖和Ang-Ⅱ可以通過(guò)不同的信號(hào)通路影響SIRT1的表達(dá)及活性，Ang-Ⅱ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并激活了P38/SIRT1通路。高糖培養(yǎng)可以激活足細(xì)胞中的AMPK/SIRT1通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在臨床應(yīng)用中，奧美沙坦能夠減少糖尿病腎病患者尿蛋白，但是在血糖控制不佳的患者中，奧美沙坦降低尿蛋白的作用并不明顯。說(shuō)明高

3、糖狀態(tài)下奧美沙坦的治療會(huì)受到影響。也提示高糖和Ang-Ⅱ可能通過(guò)不同通路誘導(dǎo)了足細(xì)胞凋亡。因此我們?cè)O(shè)想，在糖尿病腎病中，Ang-Ⅱ和高糖可能通過(guò)不同的信號(hào)通路（P38/SIRT1通路與AMPK/SIRT1通路）影響SIRT1的表達(dá)，從而導(dǎo)致了足細(xì)胞的凋亡，而奧美沙坦只能對(duì)P38/SIRT1通路起作用。
　　奧美沙坦是臨床常用的血管緊張素Ⅱ抑制劑，能夠抑制Ang-Ⅱ與血管緊張素Ⅱ受體的結(jié)合。既往認(rèn)為Ang-Ⅱ主要通過(guò)絲裂原活化蛋白激

4、酶(MAPK)，尤其是ERK1/2信號(hào)通路誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。而Ang-Ⅱ是否也能通過(guò)P38/SIRT1通路介導(dǎo)足細(xì)胞凋亡目前缺乏相關(guān)報(bào)道。
　　研究方法：
　　1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):糖尿病腎病模型db/db小鼠為糖尿病組，并分成兩組:安慰劑組（db/db+ CMC）和奧美沙坦組(db/db+OM)，C57BL小鼠作用為非糖尿病組(WT)，每組10只。在小鼠10-12周齡時(shí)，開(kāi)始藥物灌胃處理，安慰劑為0.5％羧甲基纖維素鈉(CMC)，奧

5、美沙坦劑量為每天20mg/kg。在處理的第0、2、4、6、8、10、12周測(cè)尾靜脈血糖并收集24小時(shí)尿液測(cè)尿蛋白。第12周處死動(dòng)物，留取腎組織做病理切片及提取組織蛋白，通過(guò)western blot分析蛋白通路變化。
　　2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn):在33℃條件下，條件永生化小鼠足細(xì)胞可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并且需要在培養(yǎng)基(RPMI1640)中添加10％牛血清和1×104U/L的γ干擾素;在37℃條件下細(xì)胞開(kāi)始分化，分化完成需要14天，分化時(shí)培養(yǎng)基中

6、不加γ干擾素。分化完成后給予葡萄糖、Ang-Ⅱ、奧美沙坦等刺激處理，收集細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡或提取蛋白用WesternBlot方法分析通路變化。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，利用Graphpad Prism5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和制圖。組間的差異分析方法采用one wayANOVA，定義P值＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　1.奧美沙坦治療12周后可以減少

7、db/db小鼠的尿蛋白，而不影響小鼠的體重和血糖。在db/db小鼠腎臟組織中，奧美沙坦明顯抑制p38/SIRT1通路，減少了足細(xì)胞的凋亡，但對(duì)AMPK沒(méi)有影響。
　　2.奧美沙坦能部分抑制高糖激活的AMPK/SIRT1通路，減少足細(xì)胞凋亡。
　　3.Ang-Ⅱ激活p38/SIRT1通路誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，而奧美沙坦明顯的抑制這條通路，保護(hù)足細(xì)胞;P38抑制劑s8307具有類(lèi)似作用。
　　結(jié)論:
　　本課題驗(yàn)證了SIR