中山、廣州及西安地區(qū)幾種尸食性蠅類(lèi)快速分子學(xué)鑒定.pdf

1、法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)主要是根據(jù)案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)的昆蟲(chóng)提供破案線(xiàn)索的一門(mén)學(xué)科。最早記載的法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)案例報(bào)道出自我國(guó)宋代驗(yàn)尸官宋慈的《洗冤集錄》。刑事死亡案件的偵破有賴(lài)于死亡時(shí)間迅速而精確的推斷，就法醫(yī)昆蟲(chóng)學(xué)方法而言，死亡時(shí)間的準(zhǔn)確推斷則需要對(duì)昆蟲(chóng)種類(lèi)進(jìn)行快速而準(zhǔn)確地鑒定。 但是，對(duì)死亡時(shí)間推斷有價(jià)值的主要是卵、幼蟲(chóng)、蛹等幼期的蟲(chóng)態(tài)，雖然對(duì)于成蟲(chóng)的鑒定在世界范圍已經(jīng)不成問(wèn)題，但幼期的昆蟲(chóng)的鑒定則比較困難，有時(shí)甚至是不可能的。將這些幼期的昆蟲(chóng)飼養(yǎng)到

2、成蟲(chóng)則勢(shì)必耽擱時(shí)間，如果是死的昆蟲(chóng)則無(wú)法飼養(yǎng)。 國(guó)內(nèi)外的研究表明，線(xiàn)粒體DNA細(xì)胞色素氧化酶基因的I和II亞基可用于昆蟲(chóng)種類(lèi)的鑒別。有鑒于此，我們開(kāi)展了本研究。 材料與方法： 樣本分別采集于中山市、西安市和廣州市。其中中山市標(biāo)本系用豬尸體進(jìn)行野外死亡現(xiàn)場(chǎng)模擬試驗(yàn)來(lái)收集得到，西安地區(qū)種類(lèi)是用與中山市相同的方法在兔子尸體上收集得到。廣州市標(biāo)本系用豬肝引誘成蠅產(chǎn)卵然后室溫飼養(yǎng)得到。 DNA提取干樣本DNA參照L

3、ambkin.C.L等使用的方法提取，并稍作修改。新鮮和乙醇保存樣本采用常規(guī)DNA提取方法提取。 擴(kuò)增和測(cè)序引用Sperling等文章中的引物CO-I2f和CO-I3r，擴(kuò)增線(xiàn)粒體COI基因348bp大小片段。所有的樣本均用正反向引物雙向測(cè)序。 限制性位點(diǎn)預(yù)測(cè)和限制性分析用DNASTAR軟件分析序列上限制性?xún)?nèi)切酶切割位點(diǎn)。 PCR產(chǎn)物用DdeI，Drfl和HinfI消化，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色。

4、 計(jì)算機(jī)軟件分析MEGA3.0軟件進(jìn)行分子進(jìn)化樹(shù)及各個(gè)種類(lèi)分子遺傳距離的分析。 結(jié)果： 形態(tài)學(xué)種類(lèi)鑒定樣本經(jīng)相關(guān)昆蟲(chóng)分類(lèi)學(xué)專(zhuān)家鑒定，確定分別來(lái)自麗蠅科的四個(gè)屬和蠅科。其中中山及廣州地區(qū)包括四個(gè)種，分別為緋顏裸金蠅、大頭金蠅、絲光綠蠅和厚環(huán)黑蠅，西安地區(qū)為三個(gè)麗蠅科種類(lèi)，分別為大頭金蠅、絲光綠蠅和巨尾阿麗蠅。 COI擴(kuò)增及測(cè)序所有樣本均被測(cè)序，序列數(shù)據(jù)已被GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)收錄。 限制性酶切分析分析樣本

5、COI基因位點(diǎn)(包括引物序列)348bp大小的核酸序列，這些片段用三種限制性?xún)?nèi)切酶消化切割。中山和西安地區(qū)的大頭金蠅酶切片斷完全相同，但是兩市的絲光綠蠅被DdeI和HinfI切割成不同大小的片段，厚環(huán)黑蠅序列上無(wú)DdeI和HinfI切割位點(diǎn)，而DraI和HinfI在巨尾阿麗蠅序列上無(wú)切割點(diǎn)。 COI序列分析測(cè)序的結(jié)果也可以使我們得到有關(guān)分子遺傳的信息。每個(gè)地區(qū)的各個(gè)種類(lèi)選1-3個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)序，五個(gè)種類(lèi)所有個(gè)體的DNA序列進(jìn)行比較

6、。巨尾阿麗蠅的兩個(gè)樣本的COI序列完全相同，而大頭金蠅(中山)2、3號(hào)和大頭金蠅(西安)2號(hào)樣本COI序列也完全相同，其余種類(lèi)的序列彼此都不相同。大頭金蠅和厚環(huán)黑蠅之間分歧率最高，為每348個(gè)堿基14％，麗蠅科大頭金蠅和絲光綠蠅之間的變異率為6.7％，是兩個(gè)不同種類(lèi)之間變異率最低的。 MEGA3.0軟件對(duì)序列數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，分別用鄰接法和UPGMA法構(gòu)建了兩種分子進(jìn)化樹(shù)，兩種進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果相同，均支持我們的形態(tài)學(xué)分類(lèi)結(jié)果。進(jìn)化樹(shù)在

7、DNA序列數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上形成了五個(gè)明顯的同種簇。Bootstrap評(píng)估為隨機(jī)重新分配的樣本數(shù)據(jù)的分組提供了一個(gè)可信度比率，本實(shí)驗(yàn)中五個(gè)種類(lèi)在種的水平上均形成了Bootstrap支持率為100％的單個(gè)簇。然而西安地區(qū)的絲光綠蠅與廣東省廣州市和中山市的絲光綠蠅之間有相當(dāng)大的變異。 討論在COI基因348bp大小的片段上，用三種不同的限制性?xún)?nèi)切酶區(qū)別本實(shí)驗(yàn)五個(gè)不同的種類(lèi)是可行的。中山地區(qū)與西安地區(qū)的大頭金蠅用這三種內(nèi)切酶很難區(qū)別開(kāi)來(lái)，因

8、為其種內(nèi)變異很小，無(wú)地區(qū)差異；而廣東中山和廣州兩地與西安地區(qū)的絲光綠蠅則可用DdeI或HinfI鑒別出，其種內(nèi)變異在不同的地區(qū)表現(xiàn)明顯。用DdeI限制酶可鑒別出絲光綠蠅(中山，廣州)和厚環(huán)黑蠅，DraI限制酶可鑒別出厚環(huán)黑蠅和巨尾阿麗蠅，而HinfI可將緋顏裸金蠅和西安地區(qū)的絲光綠蠅與其他幾個(gè)種類(lèi)鑒別開(kāi)來(lái)。剩下的其他種類(lèi)不能僅用一種限制性?xún)?nèi)切酶將他們區(qū)別開(kāi)，但是同時(shí)比對(duì)三種酶(DraI，DdeI和HinfI)切割的電泳圖譜即可將他們彼此

9、區(qū)別開(kāi)。僅靠未消化切割的片段是不可能鑒別出任何種類(lèi)的，因?yàn)樵谖粗紫x(chóng)出現(xiàn)的實(shí)際案例中，有可能會(huì)出現(xiàn)不包括在本研究中五個(gè)種類(lèi)之內(nèi)的其他種類(lèi)，它們的DNA也可以對(duì)同一種內(nèi)切酶保持未被消化狀態(tài)。 本研究用COI基因片段分析以及三種限制酶的消化，即可將西安地區(qū)最常見(jiàn)的三個(gè)麗蠅科種類(lèi)和廣東中山與廣州兩地最常見(jiàn)的四個(gè)尸食性蠅的種類(lèi)區(qū)別開(kāi)來(lái)，各地區(qū)的種類(lèi)間經(jīng)DdeI或HinfI限制酶切割后的片段大小各不相同，因此在廣東上述兩地或西安地區(qū)僅用其

10、中的一種限制酶就可以將其最常見(jiàn)的幾個(gè)種類(lèi)鑒別出來(lái)。 本研究的五個(gè)種類(lèi)之間的COI序列分歧相當(dāng)?shù)?，尤其在相同種類(lèi)之間。種間分歧比種內(nèi)分歧高，本研究各種類(lèi)同種分組的高支持率，證明了將COI基因用于種間種類(lèi)鑒別的潛力。本研究獲得的初步結(jié)果表明在廣東中山和廣州兩地與西安地區(qū)相同種類(lèi)的個(gè)體之間存在少量的變異，特別是西安地區(qū)的絲光綠蠅表現(xiàn)出一定程度的變異，但是很難鑒別中山和西安地區(qū)大頭金蠅，因?yàn)閮傻卮箢^金蠅該小片段COI基因的變異很低以至難

11、以表現(xiàn)出地區(qū)差異性。 目前研究的五個(gè)種類(lèi)之間的COI序列是各不相同的，這表明基于COI序列的種類(lèi)鑒定是可以實(shí)現(xiàn)的。用DNA序列鑒別未成熟階段雙翅目昆蟲(chóng)的種類(lèi)具有明顯快捷和簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，不但避免了使幼蟲(chóng)發(fā)育為成蟲(chóng)或發(fā)育到出現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)特征的等待時(shí)間，甚至在缺乏特殊形態(tài)特征的部分昆蟲(chóng)殘?bào)w上也可以鑒別出其種類(lèi)。 結(jié)論： 1.摸索出一種適用于昆蟲(chóng)干標(biāo)本的DNA提取方法，本方法較其他分子生物學(xué)方法更簡(jiǎn)便快捷。 2.可