螺旋菌pcs基因在大腸桿菌中表達(dá)與磷脂酰膽堿的合成.pdf

1、Berrelial螺旋菌pcs基因編碼磷脂酰膽堿合成酶。磷脂酰膽堿合成酶能利用膽堿作底物催化合成磷脂酰膽堿。本實(shí)驗(yàn)旨在通過建立磷脂酰膽堿合成酶(Pcs)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，讓克隆的磷脂酰膽堿合成酶基因(pcs)在大腸桿菌細(xì)胞中有效地表達(dá)，并盡可能使磷脂酰膽堿成為大腸桿菌細(xì)胞膜的主要成分，為以后研究磷脂酰膽堿(PC)成分在大腸桿菌細(xì)胞膜系統(tǒng)中功能與作用、確立磷脂酰膽堿(PC)成分與致病細(xì)菌入侵真核細(xì)胞的關(guān)系提供一個(gè)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。 根據(jù)

2、基因庫中B.burgdorferipcs基因序列設(shè)計(jì)引物pcsF、pcsR，以B.afzelii的總DNA為擴(kuò)增模板，通過PCR方法擴(kuò)增出705bp的磷脂酰膽堿合成酶基因(pcs)。以帶有T7啟動(dòng)子的pET23a和tac啟動(dòng)子的ptac85為兩種表達(dá)載體，構(gòu)建了pcs基因的兩種不同的表達(dá)載體pET23a-pcs和ptac85-pcs。在這兩種質(zhì)粒中,pcs均帶有組氨酸標(biāo)記。讓表達(dá)載體pET23a-pcs和ptac85-pcs分別在不同的

3、大腸桿菌細(xì)胞EcoliB121CodePlus(DE3)RIL和EcoliTop10中進(jìn)行表達(dá)。帶有pET23a-pcs重組質(zhì)粒的E.coliB121CodePlus(DE3)RIL轉(zhuǎn)化子和帶有ptac85-pcs重組質(zhì)粒的在含有0.4﹪(w/v)膽堿和100mg/LAmp的LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)，并用終濃度為0.5mmol/LE.coliTop10的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。TLC鑒定到了磷脂酰膽堿合成酶的合成產(chǎn)物PC，但是其合成量很低，不

4、超過細(xì)菌總磷脂數(shù)的5﹪。通過調(diào)節(jié)IPTG的使用濃度、使用時(shí)間和誘導(dǎo)時(shí)間，膽堿的使用濃度，以及培養(yǎng)基的條件，在E.coliTop10-pcs表達(dá)菌株中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)菌的O.D.600達(dá)到0.8加入0.5mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，膽堿的使用濃度為1.0﹪(w/v)，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)2-4小時(shí)后磷脂酰膽堿(PC)的合成量達(dá)到最大，可以占到大腸桿菌細(xì)胞膜磷脂組分的80﹪以上。 此外，為了獲得pss-pcs+突變株，巳構(gòu)建了自殺性載體pH