空間相鄰染色質片段捕獲技術的建立及其在α-globin基因簇和ApoAV基因座位的應用.pdf

1、從染色質水平了解基因表達調控的機制是目前分子生物學研究的熱點。目前認為，基因在基因組中的定位和基因在核內空間的定位是基因表達調控的一個重要調控水平。對該層次基因調控機制的認識也將有利于我們對基因調控網(wǎng)絡的理解。同時，基因在基因組上的定位也對其空間定位有重要影響。生物信息學對基因組序列的分析使我們得以了解基因在基因組分布的規(guī)律，然而對基因在核內空間定位的研究手段卻非常局限。最新發(fā)展起來的染色質構象捕獲技術使我們得以對染色質的空間組織結構進

2、行直接的研究。例如，已經(jīng)用該方法證明遠距離的調控序列可以通過將間隔序列環(huán)出而與被調控基因啟動子發(fā)生直接的相互作用。更為重要的是，也有研究利用該方法驗證了染色體間的功能元件間的相互作用。 非常局限的是，染色質構象捕獲技術目前只能應用到驗證可能的染色質間相互作用。事實上，更多的染色質問連接是不可能在現(xiàn)有的研究背景下被預測的。因此，為了尋找到可能的未知染色質間連接，我們通過創(chuàng)建一種新的相鄰染色質捕獲技術(ACT)結合相鄰染色質定量分析

3、技術(QACC)嘗試尋找給定染色質片段的所有高頻率連接片段。在3C模板的基礎上，我們用另外一個識別序列較短的酶對其進行酶切，以獲得兩端均為該酶切點的雜合片段。這些雜合片段在較大體積的連接體系中進行自連接環(huán)化，然后以巢式反向PCR獲得與特異連接的片段群。我們首先獲得了小鼠α-珠蛋白基因簇主增強子元件HS26為引領片段的雜合片段群，以MmeI從該片段群中的每個片段上切下19～20bp的Tags，連接為串聯(lián)體后測序。通過比較分析這些Tags的

4、出現(xiàn)頻率，就可以評估這些Tags所代表的染色質片段與HS26連接的頻率，從而確定這些片段與HS26的空間位置關系。我們總共得到超過300個Tags的序列，其中有218個片段通過BLASTn的方法定位到小鼠基因組上。結果分析表明，絕大部分的Tags是定位到小鼠α-珠蛋白基因簇上的。總的來看，這些捕獲的片段的出現(xiàn)頻率與我們以前報道的以經(jīng)典3C方法研究α-珠蛋白基因簇染色質結構的結果是一致的。例如，我們捕獲的α1和α2基因的啟動子區(qū)的頻率是2

5、8次。另外兩個重要的調控元件HS21和HS8的捕獲頻率分別是16次與3次。對于HS26上游的其它HS位點，我們均未檢測到。因此說明HS26與另外兩個調控元件HS21和HS8共同作用在14.5天的小鼠胎肝造血細胞中調控α1和α2的表達。HS26與HS21、HS8、α1和α2的啟動子區(qū)的連接頻率也與我們以前報道的3C方法的結果一致。另外，由α-珠蛋白與其上游的看家基因形成轉錄工廠的結果也得到了驗證。我們檢測到了MPG基因啟動子區(qū)和Mare基

6、因啟動子區(qū)以一定的頻率與HS26發(fā)生了連接。有趣的是，我們還通過測序的結果直接推斷出了HS26所在的NcoI片段形成了Loop的結構。 另外一個更為重要的結果是我們在α-珠蛋白基因簇的上游約500kb處發(fā)現(xiàn)了一個較高頻率的片段475A8。生物信息學分析表明該片段上富含GATA-1，SATB1的結合位點，并且含有至少一個NF-E2的結合位點。進一步的3C分析表明該片段在小鼠的胎肝和MEL細胞中均以較高的頻率與α1和α2的啟動子區(qū)相

7、連接。這表明該片段可能是一個高度保守的在α-珠蛋白基因表達中有重要作用的調控片段。為了鑒定該片段的功能，我們利用報告基因來研究該片段對α-珠蛋白基因在MEL細胞中的調控作用。結果顯示，在未誘導分化的MEL細胞中，該片段可以強烈抑制珠蛋白基因的啟動子，而在發(fā)生誘導分化的MEL細胞中，該抑制作用消失。因此，我們以一個模型來說明475A8在成年期紅系細胞分化中的作用。在分化的早期階段，475A8通過環(huán)的方式接近α1和α2基因的啟動子區(qū)，抑制其

8、表達，但是在發(fā)生分化后，由于細胞內相關蛋白的活性變化，可能導致了475A8上結合的抑制因子減少，從而喪失了抑制活性。但是有趣的是475A8似乎并沒有離開原來的位置。 我們另外還選擇了ApoAⅤ基因的啟動子區(qū)作為引領片段，對與之可能發(fā)生連接的片段進行了尋找。ApoAⅤ基因是ApoAⅤ-AⅠ-AⅣ-CⅢ基因簇的一員。BAC介導的轉基因的研究卻發(fā)現(xiàn)該基因并不接受ApoCⅢ增強子的調控。我們總共獲得超過200個染色質片段。有意思的是，這

9、些被捕獲的片段主要是來源于其它的染色體而且分布均一。沒有任何來源于ApoAⅤ-AⅠ-AⅣ-CⅢ基因簇的片段被捕獲，也沒有任何片段被捕獲的頻率能顯著的高出其它片段。因此，我們認為ApoAⅤ可能是環(huán)出了ApoAⅤ-AⅠ-AⅣ-CⅢ基因簇而參與到了另外一個有許多來源于不同染色體基因組成的轉錄工廠，以維持其基礎水平的轉錄。 對α-珠蛋白基因簇HS26相連接片段和ApoAⅤ-AⅠ-AⅣ-CⅢ基因簇ApoAⅤ基因啟動子相連接片段的比較分析表