譜系重編程獲取內胚層祖細胞及其向功能性肝細胞的誘導分化.pdf

1、肝臟是人體內負責蛋白合成、代謝物轉化和異源物質解毒等重要功能的內臟器官，由肝臟代謝性疾病和爆發(fā)性肝衰竭等引起的終末期肝病是嚴重危害全世界人類健康的重大疾病之一。目前治療終末期肝病的唯一有效手段是肝移植，但面臨著供體肝臟稀缺和免疫排斥等問題。盡管以肝細胞為基礎的細胞替代治療以及生物人工肝和組織工程肝臟等輔助治療設備已被廣泛地應用于終末期肝病的臨床治療中，卻也同樣受到了功能性肝細胞來源問題的嚴重制約。近年來，干細胞與再生醫(yī)學的快速發(fā)展為終末

2、期肝病等重大疾病的細胞治療帶來了新的希望。
　　多能干細胞（Pluripotent stem cells，PSCs）包括胚胎干細胞（Embryonic stem cells，ESCs）和誘導多能性干細胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs），具有高度自我更新能力和向幾乎所有細胞類型分化的潛能，具有重要的臨床應用價值。人們模擬胚胎發(fā)育過程，利用各發(fā)育階段所需的細胞因子能夠將多能干細胞誘導分化成肝

3、細胞，這些研究為多能干細胞來源的肝細胞應用于終末期肝病的治療帶來了希望，但是仍然存在很多問題。首先，ESCs和iPSCs都有成畸胎瘤的風險，這是 ESCs或 iPSCs來源的功能細胞應用于臨床治療存在的一個重要安全隱患。其次，目前大部分干細胞來源的肝細胞表型均與未成熟胎肝細胞相似，無法達到原代成年肝細胞的成熟度。此外，ESCs和iPSCs的全能性導致在向所需細胞類型分化的過程中會同時產(chǎn)生各種其他胚層的細胞類型，難以獲得高純度、單一譜系的

4、目的細胞。
　　基于iPSCs重編程的思路，人們建立了將一種細胞直接重編程為另一種細胞類型的方法，即譜系重編程技術。近期有多個團隊分別從對肝臟發(fā)育成熟非常關鍵的轉錄因子中篩選出不同轉錄因子組合，通過在成纖維細胞中過表達這些轉錄因子，成功地實現(xiàn)了人和小鼠來源成纖維細胞向肝細胞以及小鼠成纖維細胞向肝干細胞的直接細胞類型轉化。此外，還可以通過瞬時表達多能性轉錄因子先將成纖維細胞重編程到內胚層祖細胞階段，再利用細胞因子和小分子化合物將其分

5、化成肝細胞。這些完全或部分依賴于轉錄因子的重編程策略為基于細胞的臨床治療帶來了希望，但是對基因進行操作的方式所存在的潛在風險限制了其臨床應用。
　　小分子化合物具有穩(wěn)定、可控、廉價和安全的特性，在細胞重編程中的應用非常廣泛。單純使用小分子化合物實現(xiàn)了小鼠成纖維細胞向iPSCs的重編程以及小鼠和人的成纖維細胞向神經(jīng)細胞的直接轉化，這種完全使用化合物的重編程方式為細胞重編程提供了更為安全穩(wěn)定的策略。然而，目前為止人們仍未能夠實現(xiàn)利用小

6、分子化合物重編程的方式獲得任何一個胚層的干/祖細胞。
　　在本研究中，我們選取與肝臟發(fā)育同源的消化道上皮細胞作為起始細胞，利用小分子化合物將其重編程為誘導人內胚層祖細胞（Human induced endodermal progenitor cells，hiEndoPCs），然后將hiEndoPCs誘導分化為功能性肝細胞。我們首先建立了從胃腸手術或胃腸鏡活檢標本中分離培養(yǎng)原代上皮細胞和基質細胞的方法。發(fā)現(xiàn)在胃基質細胞作為飼養(yǎng)層細胞

7、的支持作用下，利用 Bay K8644、Bix01294、RG108和SB431542這四個小分子化合物的組合能夠將胃上皮細胞和十二指腸上皮細胞高效地譜系重編程為hiEndoPCs。hiEndoPCs表達內胚層干/祖細胞標志性基因GATA4、FOXA2、SOX9、HNF1B、PDX1、ONECUT2和HOXA3，且在全基因組轉錄水平和表觀遺傳水平上具有內胚層干/祖細胞特性，hiEndoPCs可能是一種發(fā)育階段介于原腸管（Primitiv

8、e gut tube，PGT）和后腸后段（Posterior foregut，PFG）之間的特殊的內胚層祖細胞。hiEndoPCs在體外具有一定的增殖能力，能夠在無飼養(yǎng)層培養(yǎng)條件下進行傳代和擴增，經(jīng)過凍存和復蘇后hiEndoPCs能夠維持其生長特性和分化潛能。
　　在肝細胞誘導分化條件下，hiEndoPCs可以在體外分化為表達成熟肝細胞標志性基因的肝細胞樣細胞（hiEndoPC-Heps）。DNA甲基化分析顯示TF、CYP2E1、

9、APOBEC1等肝系特異性基因的啟動子區(qū)域在hiEndoPC-Heps中處于低甲基化狀態(tài)。RNA-seq數(shù)據(jù)顯示在hiEndoPC-Heps中有大量與肝臟發(fā)育和成熟、脂肪酸代謝、葡萄糖代謝、脂蛋白代謝以及藥物代謝相關的基因表達顯著上調。更重要的是，hiEndoPC-Heps在體外具有糖原和脂滴儲存、靛青綠和低密度脂蛋白攝取、白蛋白分泌和 CYP3A4代謝等肝細胞功能，而且在體內能夠整合到肝損傷小鼠肝臟中并發(fā)揮生物學功能。
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10、EndoPCs在體外還能夠誘導分化形成表達胰腺發(fā)育關鍵性轉錄因子NKX6.1、PDX1、NGN3和胰腺特異性基因GCG、INS、SST的胰腺內分泌細胞，以及表達CDX2、VIL1、MUC2、CHGA和LYSO的腸上皮細胞。此外，hiEndoPCs還具有向肺上皮細胞和甲狀腺上皮細胞分化的潛能。然而hiEndoPCs在體內和體外均不具備向中胚層和外胚層分化的潛能，表明其分化潛能限制在內胚層。最后，我們對hiEndoPCs的安全性進行了評價，