枸杞多糖的結構分析及代謝組學研究.pdf

1、枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide，LBP)是提取自我國藥食兩用中草藥枸杞中的重要活性成分。藥效學研究表明，LBP具有降低血糖等生物學效用。而與其藥效學相比，LBP作為一種水溶性蛋白多糖，攝入后如何被消化吸收進入人體，在體內代謝生成何種物質從而發(fā)揮其功效作用等系列問題目前尚不清楚。因此，研究LBP等多糖類物質的結構特征、吸收與代謝過程，是進一步明確LBP等多糖功效發(fā)揮途徑的關鍵。本文在課題組前期研究的

2、基礎上，對LBP的化學組成及基本結構進行了初步探討;對其在大鼠體內的代謝動力學、組織分布及排泄進行了研究，初步闡明了LBP在大鼠體內的吸收、分布及排泄過程;同時采用代謝組學方法研究了給予LBP后大鼠體內代謝譜的變化，為LBP降糖作用機制研究提供新的思路，為深入研究和利用LBP等多糖類物質提供科學依據(jù)。本研究主要內容包括：
　?、臠BP的化學組成及結構分析。采用溫水浸提和膜分離法提取枸杞子中的LBP成分，樣品經(jīng)Sevage法脫蛋白、

3、水透析以及冷凍干燥等處理，先后過DEAE離子交換柱和Sephadex凝膠柱層析純化后得水溶性LBP亞組分LBP3。分別采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)和PMP柱前衍生高效液相色譜法(PMP-HPLC)對LBP3進行分子量和單糖組成分析，結果顯示LBP3的重均分子量(Mw)約為4.92 kDa;主要由D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖胺和D-木糖五種單糖殘基組成，其摩爾比為5.52∶5.11∶28.06∶1∶1.70。在此

4、基礎上，分別采用紫外光譜(UV)、傅里葉紅外光譜（FTIR）、核磁共振波譜(NMR)以及掃描電子顯微鏡(SEM)等表征手段對LBP3的結構和形態(tài)進行初步探討，結果表明，LBP3為一蛋白多糖，分子結構中含有氨基或亞氨基基團，主要由α-D-吡喃糖殘基構成，β-構型含量較低。綜合上述分析，推測LBP3可能的直鏈結構有八種。
　?、芁BP3的熒光標記及其標記物的穩(wěn)定性研究。LBP3屬于多糖類物質，分子中既無發(fā)光基團，也無發(fā)色基團，不能直接

5、利用紫外或熒光分析法進行檢測，質譜法也不適合多糖的定量分析。因此，我們在前期實驗和參考文獻的基礎上，結合LBP3的結構特點，對LBP3進行異硫氰酸酯熒光素(FITC)標記，得LBP3的熒光標記物LBP3-FITC。熒光光譜分析法檢測標記后LBP3-FITC的熒光最大激發(fā)波長Ex和發(fā)射波長Em分別為495 nm和518 nm;標記物中FTIC含量為1.3％。對LBP3-FITC進行高效凝膠色譜分析表明，其分子量與標記前比較未發(fā)生顯著變化。

6、以LBP3-FITC為研究對象，分別采用高效凝膠色譜法和熒光光譜分析法考查LBP3-FITC在磷酸緩沖液(PBS)，大鼠空白血漿、尿液以及酶溶液中的穩(wěn)定性。結果顯示，LBP3-FITC在體外PBS、大鼠血漿、尿液中經(jīng)37℃，60 r/min條件下孵育0、1、6、12、24 h后，其分子量和熒光強度均未發(fā)生顯著變化;LBP3-FITC在溶菌酶和α-淀粉酶溶液中經(jīng)37℃，60 r/min條件下孵育2、6、12h后取樣檢測也獲得類似的結果。表

7、明LBP3-FITC在體外PBS，大鼠血漿、尿液和酶溶液中能穩(wěn)定存在。同時，考查LBP3-FITC經(jīng)單次口服給予大鼠后在血漿、尿液和糞便中的穩(wěn)定性，結果表明大鼠口服LBP3-FITC后2h內的血漿、6h內的尿液和糞便中LBP3-FITC未發(fā)生顯著降解。說明大鼠口服LBP3-FITC后，主要以原型形式參與吸收和代謝。
　?、荓BP3-FITC在大鼠體內的藥代學研究。實驗首先建立了LBP3-FITC在大鼠血漿、尿液、糞便及組織中的熒光

8、定量分析方法。結果表明，LBP3-FITC的熒光強度與大鼠血漿在0.2-20μg/mL濃度范圍內線性關系良好，LBP3-FTIC在低、中、高（0.2、2.0、20μg/mL）三種濃度下的日內精密度介于1.97％-7.28％之間，日間精密度介于2.62％-7.75％之間;血漿樣品經(jīng)室溫放置24 h、反復凍融3次、-20℃下凍存15天處理后穩(wěn)定性并未受到影響;LBP3-FITC在低、中、高三種濃度下組內加樣回收率介于84.6％-104.0％

9、之間，組間回收率介于98.3％-100.2％之間。此外，LBP3-FITC在大鼠尿液、糞便和組織中的線性、精密度、穩(wěn)定性以及回收率分析均符合生物樣品體內定量分析要求，表明本實驗方法適用于LBP3-FITC在大鼠血漿、尿液等生物樣品中含量的測定。利用LBP3-FITC在大鼠生物樣品中的熒光定量分析方法對其在大鼠體內的代謝動力學進行研究。結果表明單次口服給予大鼠100、50、25 mg/kgLBP3-FITC后，LBP3-FITC的藥-時曲

10、線下面積AUC0-t分別為151.09±15.10，141.25±12.02，128.21±27.64mg/L.h; AUC(0-∞)分別為230.49±73.26，236.18±35.08，242.57±64.09 mg/L.h;最大峰濃度Cmax分別為7.44±0.72，6.56±0.51，5.27±0.44 mg/L;三種劑量下LBP3-FITC平均消除半衰期t1/2為38.41±9.55 h。表明LBP3-FITC在大鼠體內半衰

11、期長，消除緩慢。大鼠單次口服給予LBP3-FITC后，組織分布實驗表明，給藥后1h，LBP3-FITC能分布到大部分組織中，在小腸和胃中分布較高，另外主要分布在肝臟、腎臟、大腸、心臟等組織;給藥6h后，胃和小腸組織中LBP3-FITC濃度明顯下降，腎臟、肝臟、大腸中LBP3-FITC濃度明顯升高，表明LBP3-FITC吸收入血后主要經(jīng)腎臟隨尿液排出;給藥24 h后，大部分組織中LBP3-FITC濃度明顯降低。大鼠經(jīng)單次口服給予LBP3-

12、FITC后，大鼠尿液和糞便中LBP3-FITC的累積排泄量分別為0.094±0.036％和92.18±3.609％，說明大鼠單次灌胃給予SD大鼠LBP3-FITC后72 h內，有相當于給藥量92.274％的LBP3-FITC隨尿液和糞便排出體外，而且主要從糞便中排出。表明LBP3在動物體內吸收率不高。
　　⑷LBP3在大鼠血清、尿液和肝臟中的代謝組學研究。建立了適用于血清代謝物譜研究的氣相色譜-飛行時間質譜(GC-TOF MS)技

13、術并用于對照組（NC組）、2型糖尿病模型組（DM組）及枸杞多糖干預DM大鼠組（LBP3組）大鼠血清代謝物譜的分析。采用主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別法(OPLS-DA)等模式識別方法對NC組、DM組及LBP3組大鼠血清代謝物譜進行分類并從血清中尋找與2型糖尿病相關的潛在生物標志物。所建立的方法能將三組大鼠血清代謝物譜分離，DM大鼠血清中丙氨酸、胸腺嘧啶脫氧核苷酸相對于NC組大鼠顯著降低。LBP3干預DM組大鼠一個月后，LBP3

14、干預組大鼠血清中丙氨酸、胸腺嘧啶核苷酸含量有所上升。血清中這兩類物質可能與氨基酸代謝和核苷酸代謝有關，LBP3組大鼠與DM組大鼠血清中丙氨酸和胸腺嘧啶核苷酸水平的變化體現(xiàn)了體內氨基酸和核苷酸代謝的改變。建立了適用尿液代謝物譜研究的GC-TOF MS技術并用于NC組、DM組及LBP3組大鼠尿液代謝物譜的分析。采用PCA、OPLS-DA等模式識別方法對NC組、DM組及LBP3組大鼠尿液代謝物譜進行分類并從尿液中尋找與2型糖尿病相關的生物標志

15、物。所建立的方法能將三組大鼠尿液代謝物譜很好區(qū)分，DM大鼠尿液中甲基丙二酸、苯甲酸、半乳糖醛酸水平明顯升高而2，3-二羥基丁酸、嘌呤核苷明顯降低。LBP3干預一個月后這些代謝物有向正?；謴偷内厔荨BP3干預組和DM組大鼠尿液中甲基丙二酸、2，3-二羥基丁酸、嘌呤核苷、苯甲酸水平的變化提示可能存在氧化應激、氨基酸代謝、核苷酸代謝和腸道菌群的改變。建立了適用肝臟組織代謝物譜研究的GC-TOF MS技術并用于NC組、DM組及LBP3組大鼠肝

16、臟代謝物譜的分析。采用PCA、OPLS-DA等模式識別方法對NC組、DM組及LBP3組大鼠肝臟代謝物譜進行分類并從肝臟組織中尋找與2型糖尿病相關的生物標志物。所建立的方法能將三組大鼠肝臟代謝物譜完全分開，DM大鼠肝臟中肌醇、羥基丁酸、泛酸水平顯著降低而L-蘋果酸、3，6-脫水-D-半乳糖、花生酸等水平顯著升高，LBP3干預一個月后這些代謝物有向正?；謴偷内厔?。LBP3干預組和DM組大鼠肝臟中蘋果酸、羥基丁酸、肌醇、花生酸水平的變化提示可

17、能存在三羧酸循環(huán)、胰島素敏感性和脂肪代謝的改變。
　　⑸研究表明：經(jīng)柱層析純化獲得LBP亞組分LBP3主要由五種單糖殘基組成，分子中含有氨基或亞氨基基團，初級結構主要由α-D-吡喃糖殘基構成，β-構型含量較低；利用LBP3與FITC之間的共價偶聯(lián)作用，成功將FITC標記在LBP3分子上，LBP3標記前后分子量未發(fā)生明顯改變。標記物LBP3-FITC在動物體內外生物樣品中顯示出較好的穩(wěn)定性；建立的LBP3-FITC熒光定量分析方法具

18、有較高的精密度、穩(wěn)定性和回收率，適用于LBP3-FITC在大鼠血漿、尿液等生物樣品中含量的測定；大鼠單次口服給予LBP3-FITC后在動物體內半衰期長，消除緩慢。且給藥1、6、24 h后，隨著時間的延長，LBP3-FITC不同組織中濃度變化明顯，24 h后大部分組織中濃度顯著降低；建立了適用于糖尿病大鼠血清、尿液和肝臟組織代謝物譜研究的GC-TOF MS技術，多元統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)DM組大鼠血清、尿液和肝臟組織中眾多代謝物濃度與NC組相比均發(fā)