低剪切應力對小鼠腹主動脈重建的影響及其作用機制的研究.pdf

1、背景和目的：
　　 動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)導致的心腦血管疾病是危害人類健康的主要原因之一,AS的致病機理一直是心血管領域的研究熱點,粥樣斑塊常出現(xiàn)于動脈特定部位(血流低速區(qū),回流區(qū)等),最主要的脂質浸潤學說、血栓形成學說、單克隆學說和損傷反應學說等并不能完全解釋 AS發(fā)生的局灶性(localization of atherosclerosis),而血流動力學因素在 AS發(fā)生條件中具有主要的作用,血流

2、動力學成因理論為認識AS的局灶性和發(fā)病機制提供了新的視角,與作用時間相關的血流剪切應力,尤其是低剪切應力(low shear stress)大小、方向的改變,可通過引起血管重建(vascular remodeling)和內(nèi)皮黏附分子(endothelial adhesion molecule)表達的上調,導致內(nèi)皮炎癥的發(fā)生,從而在AS的發(fā)生、發(fā)展中起著關鍵作用。
　　 正常范圍的血流剪切應力對于維持血管穩(wěn)態(tài)包括抗血栓形成、屏障功

3、能和血管本身的動態(tài)平衡有重要的調節(jié)作用,血流剪切應力改變后血管穩(wěn)定性受到破壞,將致使血管重建的發(fā)生。血管重建是指為適應內(nèi)、外環(huán)境(尤其是力學環(huán)境)的變化而發(fā)生的血管形態(tài)結構和功能的一系列適應性改變,包括早期組分不變的適應性重排和晚期結構與功能改變的病理性重建,而病理性的血管重建是動脈粥樣硬化、高血壓和血管再狹窄等常見心腦血管病變共同的病理基礎,但是造成血管重建的細胞分子生物學機制尚不清楚。剪切力學說認為,均勻的層流剪切力可選擇性地誘導內(nèi)

4、皮抗動脈粥樣硬化基因的表達,作用于局部以抵消全身危險因素的有害作用,當剪切力的性質和大小出現(xiàn)異常,內(nèi)皮分泌抗動脈粥樣硬化分子減少,促炎因子表達增加,從而激活相應的信號轉導通路,參與誘導炎癥進展,導致血管重建和AS的發(fā)生、發(fā)展。
　　 炎癥細胞與內(nèi)皮細胞的粘附和跨壁轉移是AS形成機制的第一步,正常情況下白細胞很難與內(nèi)皮黏附,只有當外來因素如細胞因子、氧化脂蛋白、切應力等與內(nèi)皮相互作用后使內(nèi)皮表面不表達或低表達的粘附分子如:細胞間粘

5、附分子-1(ICAM-1)、VCAM-1、P-選擇素和 E-選擇素等表達增加,有助于各種白細胞的粘附。其中 P-選擇素(P-selectin)在動脈病變早期對活化的血小板、白細胞與內(nèi)皮細胞的初次黏附起決定性作用,是啟動內(nèi)皮炎癥反應并維持炎癥狀態(tài)的關鍵成分,正常的內(nèi)皮細胞僅表達極少量無介導白細胞活性的 P-選擇素,在血流低切應力等因素持續(xù)作用下,通過進一步的脂質堆積、內(nèi)皮功能改變等引起炎癥刺激內(nèi)皮,內(nèi)皮才表達具有介導炎癥細胞活性的 P-選

6、擇素；而血管內(nèi)皮黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)主要在后續(xù)的白細胞與內(nèi)皮細胞的緊密黏附及介導白細胞滲出、遷移過程中起作用,正常條件下內(nèi)皮不表達 VCAM-1,理化因素(如血流剪切應力異常等)刺激損傷內(nèi)皮后表達增加,并有延遲表達或持續(xù)長久的特點,可促進對內(nèi)皮的損傷,亦是維持內(nèi)皮炎癥狀態(tài)的關鍵成分之一。因此,如果血流剪切應力異常是 AS發(fā)生的始動因素,內(nèi)皮表達的 P-選擇素、V

7、CAM-1等粘附分子則可能是AS形成的樞紐之一。
　　 如能盡早檢測出反映血流動力學變化的綜合指標,深入研究剪切力變化早期引起的血管生物學效應以及其與 AS形成之間的關系和作用機制,對進一步揭示AS的本質、探索防治AS的方法有重要的理論和實際意義。
　　 目前已有研究發(fā)現(xiàn),大小、形態(tài)異常的血流剪切應力作用可通過影響多種炎癥分子的表達而導致不同性質的粥樣斑塊形成,但有關血流動力學變化早期,低剪切應力作用對動脈病變早期血管重

8、建的影響及其相關分子生物學機制尚不清楚。為此,本研究擬通過制備小鼠腹主動脈局部狹窄模型,在同一段平直血管上建立近似層流和振蕩流的低剪切應力區(qū)域,觀察血流動力學改變短時間內(nèi)不同形態(tài)低剪切應力對動脈重建和內(nèi)皮 P-選擇素表達的影響,并在此基礎上較長時間觀察近似層流低剪切應力作用下動脈病理形態(tài)學與內(nèi)皮 P-選擇素、VCAM-1等黏附分子表達的動態(tài)變化,以進一步了解低剪切應力引起的血管生物學效應與早期 AS發(fā)生、發(fā)展之間的關系及其作用機制。

9、r>　　 材料和方法：
　　 1、實驗動物分組:①短時間觀察組:20只昆明小白鼠,性別不限,體重(18.0～2.0)g,隨機分為短時間對照組和短時間觀察組(狹窄1h,4h,24h組),每組5只；②長時間觀察組:25只昆明小白鼠,性別不限,體重(18.0～2.0)g,隨機分為長時間對照組和長時間觀察組(狹窄1d,7d,14d,28d組),每組5只。
　　 2、腹主動脈局部狹窄模型制備:狹窄組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后,

10、仰臥位固定四肢,腹部去毛后75％酒精消毒皮膚,取正中線剪開皮膚及腹壁,移開腸腔并用溫鹽水紗布保濕,分離左腎動脈分支與髂動脈分叉之間腹主動脈,平直段放置內(nèi)徑0.1mm動脈銀夾,小心回置腸腔,無菌縫合切口關閉腹腔,對照組組小鼠只分離,未放置銀夾。對照組于術后即刻,短時間組于術后1、4、24h,長時間組于術后1、7、14、28d行彩超檢查,再從原切口開腹,從心臟采血1ml置抗凝管待測血粘度,暴露腹主動脈,用冰丙酮灌注固定后,分別取出短時間組銀

11、央近心端及遠心端、長時間組銀夾近心端及對照組腹主動脈組織各約5mm,液氮速凍待冰凍切片染色觀察。
　　 3、血流動力學參數(shù)測定:將超聲高頻探頭置于小鼠腹部,分別測量短時間組銀夾近心端及遠心端、長時間組銀夾近心端5mm內(nèi)血流動力學參數(shù):舒張末期血管內(nèi)徑(D)、最大血流速度(V m),每只小鼠測10次最后取平均值?？鼓?h內(nèi)用毛細血管黏度計測量血液粘度(η)(低切)。根據(jù)公式τm=η×4×Vm/D計算血流剪切應力(τm)。

12、>　　 4、動脈HE染色與形態(tài)學分析:采用冰凍切片常規(guī)HE染色方法,5μm不連續(xù)切片,4℃冰丙酮固定30 s稍水洗,蘇木素染色40s~60s后水洗5s~10s(必要時1％鹽酸酒精分化溫水返藍),伊紅滴后速洗,梯度酒精脫水、二甲苯透明,中性樹膠封片,每條動脈組織隨機抽取2張切片,光鏡下觀察血管壁形態(tài)結構,AutoCad圖像分析軟件測量血管內(nèi)徑與壁厚。
　　 5、內(nèi)皮粘附分子免疫組織化學染色與量化分析:短時間組檢測內(nèi)皮P-選擇素,

13、長時間組與對照組檢測內(nèi)皮P-選擇素與VCAM-1。各組在相同條件下采用二步法檢測,5μm冰凍切片置室溫30min,4℃冰丙酮固定10 min(PBS洗5 min×3次),加過氧化氫室溫10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性(PBS洗5 min×3次),5％～10％山羊血清封閉10min傾去勿洗,滴加一抗置4℃冰箱過夜后室溫復溫30min(PBS洗5 min×3次),加二抗工作液室溫30min,DAB顯色,蘇木精復染,脫水透明后封片觀察并攝

14、片。每個標本隨機抽取2張不連續(xù)切片,用IPP圖像分析系統(tǒng)進行陽性染色吸光度的量化分析。
　　 結果：
　　 1、血流動力學參數(shù)檢測結果顯示:各實驗組動物腹主動脈內(nèi)徑(D)和血液黏度(η)之間無統(tǒng)計學差異；狹窄組銀夾近心端血流近似層流,其最大血流速度(V m)和血流剪切應力(τm)較對照組減低,差異有統(tǒng)計學意義,銀夾遠心端血流形成了振蕩性渦流區(qū),血流速度極低,超聲的分辨率未能檢測到具體波形,剪切應力趨向于0。提示成功制備低

15、剪切應力模型,并在同一段血管上形成了不同形態(tài)的低剪切應力血流區(qū)。
　　 2、腹主動脈病理形態(tài)學觀察與分析結果顯示:對照組血管內(nèi)皮光整,長梭形平滑肌細胞排列均勻；狹窄組動脈管壁不均勻增厚,內(nèi)中膜增厚凸向管腔,可見脫落細胞核,平滑肌細胞增生明顯,細胞核縮短呈層多形狀,且隨狹窄時間的增加內(nèi)皮與平滑肌細胞核形態(tài)與分布逐漸紊亂,炎性細胞浸潤逐漸增多。與對照組比較,短時間組近心端及遠心端內(nèi)-中膜均顯著增厚,且以近心端為甚；長時間組狹窄1d已

16、有動脈壁增厚、內(nèi)徑減少、壁厚內(nèi)徑比增大,隨著時間的延長,狹窄7、14、28d組動脈內(nèi)徑逐漸減小,動脈壁增厚與壁厚內(nèi)徑比進一步增大。提示不同形態(tài)的低剪切應力導致的病變程度是不同的,所引起的血管生物學效應與作用時間和強度有關。
　　 3、內(nèi)皮 P-選擇素與 VCAM-1的表達結果顯示:對照組血管內(nèi)皮無明顯 P-選擇素與 VCAM-1表達；短時間組近心端及遠心端內(nèi)皮均有明顯 P-選擇素表達,而且近心端內(nèi)皮染色更為顯著；長時間組近心端內(nèi)

17、皮 P-選擇素的表達在1d開始明顯上調并持續(xù)至28d,但隨作用時間的延長在7d達高峰后呈下降趨勢,而內(nèi)皮 VCAM-1表達在7d才開始顯著上調,14d達高峰并持續(xù)保持高水平表達。提示各種黏附分子對血流剪切應力的敏感性可能不同。
　　 結論：
　　 1、血流低剪切力較短時間內(nèi)即可引起動脈重建和上調內(nèi)皮 P-選擇素表達；
　　 2、不同形態(tài)低剪切力導致的動脈病變不同,近似層流較振蕩流引起的動脈病理改變更為顯著；