辣椒脈斑駁病毒文昌分離物全基因組序列分析和抗血清的制備.pdf

1、辣椒是一種重要的茄科類蔬菜作物,因其果實營養(yǎng)豐富,特別是維生素C的含量在蔬菜中居第一位而深受人們喜愛。然而,近年來,辣椒病毒病已成為辣椒生產發(fā)展的主要限制因素之一。辣椒脈斑駁病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是辣椒上主要的病毒病害之一,它的存在嚴重制約著世界各地的辣椒生產,特別是韓國、馬來西亞、泰國、印度等國和臺灣等地區(qū),辣椒的種植面積與產量均明顯下降。辣椒脈斑駁病毒是一種(+)ssRNA病毒,為

2、馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)、馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)。盡管國內外對Potyvirus屬的許多成員的基因組結構和基因產物功能、以及病毒的株系分化和遺傳變異有了較深入的研究,但相比較而言,對于ChiVMV的這些方面的研究尚顯不夠。目前ChiVMV全基因組進行克隆分析的報道不多,僅見報道的有印度與韓國兩個分離物,國內還沒有相關報道。對其基因功能的研究也大都是與同屬其它成員進行比對后推導得出的,而用分子生物學方法研究C

3、hiVMV株系分化和遺傳變異的報道更為鮮見。本文以文昌地區(qū)染病黃燈籠辣椒葉片的總RNA為模板,通過RT-PCR技術克隆了ChiVMV-WC分離物的全基因組序列,利用多種生物學軟件對該病毒的基因組全序列結構特征進行了分析和預測,并確定它的分類地位;作者在ChiVMV-WC分離物的全基因組序列分析的基礎上對編碼基因CP進行原核表達及制備特異性抗血清,為ChiVMV的檢測體系的建立打下基礎。本文獲得的主要結論如下:
　　 1.成功克隆

4、了ChiVMV-WC分離物全基因組序列,基因組全長為9717 nt,包含一個長9270 nt的單一開放閱讀框(ORF),編碼一個350.44 kDa的多聚蛋白。與其它馬鈴薯Y屬病毒一樣,多聚蛋白內有9個推定的保守酶切位點,切割產生10個成熟蛋白。
　　 2.ChiVMV-WC與報道的印度與韓國分離物(AJ237843和AJ972878)全基因組序列同源性分別為85.66％和93.54％,編碼多聚蛋白氨基酸序列同源性分別為89.8

5、4％和94.17％。通過與馬鈴薯Y病毒屬其他成員的多聚蛋白氨基酸序列比對,我們確定ChiVMV-WC分離物為Potyvirus屬成員。CP和3'-UTR序列的相似性被認為是Y屬病毒最重要的分類依據,通過CP氨基酸和3'-UTR序列的比對,我們認為與ChiVMV-VN/C7越南分離物的親緣關系最近。
　　 3.根據所測的ChiVMV序列設計一對引物,PCR擴增出ChiVMV-WC分離物的CP基因,將其插入到Pet-30b(+)載體

6、中,然后將獲得的重組質粒pET30b-ChiVMV CP轉化大腸桿菌Rosetta(DE3)后,用IPTG進行誘導表達,SDS-PAGE分析,結果顯示CP基因高效表達,主要以蛋白可溶性形式穩(wěn)定表達。通過對誘導條件的優(yōu)化,確立了CP基因的表達條件:IPTG終濃度為0.1 mmol/L,誘導時間為2 h。
　　 4.用Ni2+-NTA瓊脂糖親和層析純化的融合蛋白免疫兔子并獲得抗血清。通過酶聯法(ID-ELISA)測定本實驗制備的Ch