肽脫甲?；傅谋磉_(dá)純化及其抑制劑的研究.pdf

1、目的：
　　 肽脫甲?；?PDF，peptide deformylase)是篩選新型抗生素的一個(gè)理想靶點(diǎn)，其抑制劑的研究引起了廣泛的關(guān)注。在本研究中，通過不同的表達(dá)純化方法，獲得穩(wěn)定性好、活性高的大腸桿菌和金黃色葡萄菌的PDF，建立PDF抑制劑的篩選模型。檢測(cè)其抑制劑對(duì)兩種PDF的抑制效果，同時(shí)檢測(cè)PDF抑制劑的最小抑菌濃度(MIC，minimal inhibitory concentration)，對(duì)抑制劑進(jìn)行篩選。為PDF

2、性質(zhì)的研究和新型抗生素的篩選奠定良好的基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.將大腸桿菌PDF表達(dá)質(zhì)粒pET-22b-def轉(zhuǎn)入宿主大腸桿菌BL21(DE3)中，對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的條件進(jìn)行摸索，并進(jìn)行PDF蛋白的大量表達(dá)。
　　 2.通過離子交換層析和分子篩層析，對(duì)大腸桿菌PDF進(jìn)行純化。
　　 3.檢測(cè)大腸桿菌PDF的活性及穩(wěn)定性。
　　 4.構(gòu)建金黃色葡萄球菌PDF重組表達(dá)質(zhì)粒pET-22b-def。

3、>　　 5.將金黃色葡萄球菌PDF表達(dá)質(zhì)粒pET-22b-def轉(zhuǎn)入宿主大腸菌BL21(DE3)中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，采用瓊脂糖磁珠對(duì)其進(jìn)行純化，得到不含離子的PDF；在純化過程中加入氯化鎳，得到鎳離子PDF；在表達(dá)和純化過程中加入氯化鐵，得到富含鐵離子的PDF。
　　 6.對(duì)金黃色葡萄球菌三種不同形式的PDF進(jìn)行活性比較，并對(duì)抑制劑篩選模型的條件進(jìn)行摸索，建立合適的篩選模型。
　　 7.檢測(cè)化合物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球

4、菌PDF的IC50值。
　　 8.應(yīng)用微量稀釋法敏感實(shí)驗(yàn)的方法檢測(cè)了39種化合物對(duì)4株革蘭陰性菌和4株革蘭陽性菌的MIC值。
　　 結(jié)果：
　　 1.在30℃下，經(jīng)0.2mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)，大腸桿菌PDF蛋白在宿主菌中得到大量表達(dá)。1L菌液可表達(dá)蛋白約30mg。
　　 2.經(jīng)過離子交換層析和分子篩層析純化后，得到了高純度的大腸桿菌Ni2+-PDF蛋白。
　　 3.活性檢測(cè)證實(shí)我們得到了活性

5、高、穩(wěn)定性好的大腸桿菌Ni2+-PDF蛋白，可用于PDF抑制劑的篩選。
　　 4.重組菌落PCR鑒定和基因測(cè)序表明，我們成功構(gòu)建了金黃色葡萄球菌PDF表達(dá)質(zhì)粒pET-22b-def。
　　 5.在不同的表達(dá)和純化條件下，得到了高純度的未加入離子的PDF、含鎳離子PDF、富含鐵離子PDF三種不同形式的金黃色葡萄球菌PDF蛋白。
　　 6.金黃色葡萄球菌不含離子PDF、鎳離子PDF和富含鐵離子PDF經(jīng)活性比較發(fā)現(xiàn)，富

6、含鐵離子PDF活性最高，并用于體外PDF抑制劑的篩選實(shí)驗(yàn)。
　　 7.檢測(cè)了39種化合物對(duì)大腸桿菌PDF抑制效果，與陽性對(duì)照藥物放線酰胺(actinonin)相比較，未發(fā)現(xiàn)抑制效果優(yōu)于actinonin的藥物。另外檢測(cè)了19種化合物對(duì)金黃色葡萄球菌PDF的抑制效果，亦未發(fā)現(xiàn)抑制效果優(yōu)于actinonin的藥物。
　　 8.在微量稀釋法敏感實(shí)驗(yàn)中，與陽性對(duì)照藥慶大霉素相比，所篩選化合物抑菌效果差于慶大霉素，與actinon

7、in相比，BLC-44對(duì)大腸桿菌和克雷伯肺炎桿菌的抑菌效果優(yōu)于actinonin，其他藥物抑菌效果不及actinonin。
　　 結(jié)論：
　　 經(jīng)表達(dá)純化，獲得了穩(wěn)定性好及活性高的大腸桿菌Ni2+-PDF和金黃色葡萄球菌的富含鐵離子PDF蛋白，并建立了PDF抑制劑的篩選的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。?duì)化合物進(jìn)行了篩選，與陽性對(duì)照藥actinonin相比，未發(fā)現(xiàn)抑制效果優(yōu)于actinonin的藥物。在MIC的檢測(cè)中，亦未發(fā)現(xiàn)抑菌效果好藥物。