TFEB通過調(diào)節(jié)自噬降低腫瘤細胞對阿霉素的敏感性.pdf

1、目的：觀察化療藥物阿霉素對腫瘤細胞轉(zhuǎn)錄因子EB（TFEB）蛋白表達的影響；探討TFEB是否通過自噬影響腫瘤細胞對阿霉素的敏感性。
　　方法：細胞免疫熒光法檢測阿霉素對腫瘤細胞內(nèi)源性 TFEB及外源性GFP-TFEB細胞內(nèi)分布的影響；細胞核質(zhì)分離技術(shù)分離細胞核，Western blot檢測阿霉素對細胞質(zhì)及細胞核中 TFEB蛋白表達的影響；采用質(zhì)粒 GFP-TFEB過表達和小干擾 RNA干擾腫瘤細胞內(nèi)TFEB蛋白水平后，CCK8法檢測

2、過表達和干擾 TFEB對阿霉素抑制腫瘤細胞作用的影響；細胞克隆形成實驗檢測干擾 TFEB對阿霉素抑制腫瘤細胞增值能力的影響；Hoechst染色檢測干擾 TFEB聯(lián)合阿霉素對腫瘤細胞凋亡的影響；Western blot檢測干擾 TFEB聯(lián)合阿霉素對腫瘤細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3蛋白表達的影響；Western blot檢測過表達和干擾 TFEB聯(lián)合阿霉素對腫瘤細胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白 LC3表達的影響；使用自噬抑制劑3-MA及干擾自噬基

3、因ATG5抑制自噬后，CCK8法檢測自噬抑制后過表達 TFEB對阿霉素抑制腫瘤細胞增殖能力的影響。
　　結(jié)果：免疫熒光結(jié)果顯示，阿霉素作用后，Lovo細胞內(nèi)源性 TFEB及外源性GFP-TFEB從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核；核質(zhì)分離后Western blot結(jié)果顯示，阿霉素作用后，Lovo細胞內(nèi)TFEB在細胞質(zhì)中表達降低，在細胞核中表達增高；CCK8法結(jié)果顯示，過表達TFEB后，阿霉素對結(jié)腸癌Lovo細胞和宮頸癌HeLa細胞的增殖抑制作用

4、降低，而干擾TFEB后，阿霉素對Lovo細胞和HeLa細胞的增殖抑制作用上升；細胞克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，干擾TFEB后，阿霉素對Lovo細胞長期存活的抑制能力增強；Hoechst染色結(jié)果顯示，干擾 TFEB增加阿霉素誘導(dǎo)的 Lovo細胞凋亡；Western blot結(jié)果顯示，干擾 TFEB增加阿霉素誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白 Caspase-3表達上調(diào)；Western blot結(jié)果顯示，阿霉素作用后，Lovo細胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3表達上調(diào)，過表達

5、TFEB增加阿霉素誘導(dǎo)的LC3表達上調(diào)，而抑制TFEB降低阿霉素誘導(dǎo)的LC3表達上調(diào)，且單獨干擾TFEB后LC3表達下調(diào)；使用自噬抑制劑3-MA和干擾ATG5來抑制自噬后，CCK8結(jié)果顯示，過表達TFEB對Lovo細胞增殖的促進作用消失。
　　結(jié)論：阿霉素誘導(dǎo)腫瘤細胞TFEB入核；TFEB降低腫瘤細胞對化療藥物阿霉素的化療敏感性，減少阿霉素引起的細胞凋亡，促進腫瘤細胞生存；TFEB調(diào)節(jié)阿霉素誘導(dǎo)的自噬激活；抑制自噬拮抗TFEB誘導(dǎo)