NMMO直接溶解法制備纖維素微球介質及疏水性電荷誘導層析應用.pdf

1、從復雜料液中分離單一種類蛋白是一項非常艱巨的任務，需要經(jīng)過一系列分離純化步驟才能實現(xiàn)。與傳統(tǒng)的化學產(chǎn)品的分離純化相比，蛋白質純化擁有明顯的不同。首先，蛋白質對于外部條件非常敏感，劇烈的變化會造成蛋白質三維結構的破壞，因此要求蛋白質純化過程溫和可控。其次，目標蛋白所在的培養(yǎng)液中的含量通常較低，而且存在大量的雜質成分，這給蛋白質純化造成了較大困難，收率低、成本高，因此選擇合適的蛋白質分離純化技術具有重要意義。
　　在各種蛋白質分離純化

2、方法中，層析技術是最重要的一類，該技術始于1906年Mikhail Tswett的發(fā)現(xiàn)。根據(jù)操作模式的不同，層析技術可以分為固定床、流化床以及擴張床。固定床是最為傳統(tǒng)的層析操作模式，技術成熟，分辨率高，但是含有顆粒的料液會導致固定床床層堵塞，因此進入固定床的料液需進行前處理。流化床則可以直接處理含有顆粒的料液，但是流化床中溝流，返混現(xiàn)象嚴重，導致流化床分離效率較差，回收率低。擴張床是一種新型的層析操作模式，和流化床一樣，可以實現(xiàn)從含有顆

3、粒的料液中直接分離目標蛋白，擴張床床層與固定床相似，保持了相對穩(wěn)定，因而保持了較高的分辨率和較好的分離效果。擴張床結合了固定床和流化床的優(yōu)勢，將固液分離、初步純化以及蛋白濃縮集成為一個單元，是一項非常有潛力的新型集成化層析技術。
　　擴張床的基本操作流程如下：首先，平衡緩沖液從床層底部以一定流速通入，在自下而上的液流作用下，具有一定的粒徑與密度分布的介質向床柱上部移動，床層發(fā)生膨脹。當重力、阻力、拖曳力等作用力達到平衡時，不同粒徑

4、和密度的介質顆粒停止運動，停留在床層不同高度在床柱中形成穩(wěn)定的床層分布。當床層穩(wěn)定膨脹并完成平衡后，切換通入料液，料液中的顆粒物質，如細胞或細胞碎片等，可以通過顆粒之間存在空隙，而不堵塞床層，目標蛋白則被介質顆粒吸附。然后切換回平衡溶液，對床層進行沖洗，將未吸附的蛋白與雜質沖走。之后以洗脫液洗脫介質吸附的目標蛋白。完成洗脫后對床層進行再生和沖平衡，進入下一循環(huán)。由此可見，特殊設計的介質是實現(xiàn)擴張床運行的基礎，決定了擴張床的吸附性能和分離

5、效率。在用于制備擴張床介質的各類材料中，纖維素是一種優(yōu)秀的備選對象。但是傳統(tǒng)的纖維素介質主要通過纖維素黃酸酯方法來制備，反應條件苛刻，過程難以控制，且需要昂貴的試劑，一些副產(chǎn)物對環(huán)境有害。因此，本論文采用了N-甲基氧化嗎啉(N-methyl morpholineoxide，NMMO)作為非衍生化“綠色”溶劑，直接溶解纖維素，并添加碳化鎢作為增重劑，制備成纖維素-碳化鎢復合微球基質。
　　在吸附模式的選擇上，本文選擇了疏水性電荷誘導

6、層析(Hydrophobic charge-induction chromatography，HCIC)。HCIC是一種新型的層析技術，與其他傳統(tǒng)的層析技術相比，HCIC擁有以下優(yōu)勢:其一、HCIC介質具有較好的耐鹽吸附能力，可以在較寬的鹽濃度范圍沒保存良好的吸附性能，因此無需對料液進行加鹽后稀釋操作，節(jié)省前處理過程;其二、洗脫條件較為溫和，減少了抗體變性或聚集的情況;其三、HCIC介質性質穩(wěn)定，可以承受較為苛刻的再生條件;其四、HCI

7、C配基結合牢固，不會污染目標產(chǎn)物。因此，本文選擇HCIC配基2-巰基咪唑(2-mercaptoimidazole，MI)偶聯(lián)到纖維素基質上，制成疏水性電荷誘導層析介質，考察了新介質的蛋白吸附性能，并應用于免疫球蛋白G(IgG)的分離純化。
　　具體研究內容如下：
　　(1)纖維素是地球上最為豐富的聚合物，是植物細胞重要的組成成分。纖維素是由葡萄糖組成的線性多聚體，含有大量氫鍵，是制備多孔顆?；|的潛在材料。但是大量氫鍵的存在

8、導致纖維素形態(tài)穩(wěn)定，為了更好地利用纖維素進行制備，首先要對纖維素進行溶解。但是傳統(tǒng)的溶解方法，比如纖維素黃酸酯方法，存在諸如成本過高或環(huán)境污染等不足。NMMO是一種無毒的、環(huán)狀、脂肪族叔胺氧化物，常被用作有機合成中的氧化物。因為N-O的存在，NMMO擁有高度的極性，可溶于水，并形成氫鍵?；谶@些特性，NMMO被研究者用于溶解纖維素，取得了良好的效果。
　　本文使用NMMO作為溶劑，配合反相懸浮法制備纖維素-碳化鎢復合微球，具體過程

9、見圖1。
　　具體制備方法如下：使用NMMO作為非衍生化溶劑，在高溫條件下直接溶解纖維素，加入碳化鎢作為增重劑，充分攪拌混勻。為了防止與外界空氣進行水分交換，整個反應體系置于干燥氮氣環(huán)境下，同時加入抗氧化劑防止NMMO的降解。之后將纖維素-碳化鎢懸浮液轉入水相中，繼續(xù)攪拌，同時降低溫度，使纖維素結晶成球。在制備過程中，研究了纖維素溶解溫度和時間、纖維素/NMMO/水混合溶液中的水含量、纖維素濃度、分散體系以及冷卻過程對制備纖維素微

10、球的影響。結果顯示，纖維素的溶解度隨著溫度的提高以及時間的增加而增加，對于4 wt％纖維素溶液，105～110℃、反應30 min較為合適，進一步提升溫度，則會造成NMMO的降解，不利于纖維素溶解。含水量對纖維素/NMMO/水混合溶液形成均一溶液非常重要，研究發(fā)現(xiàn)11～15 wt％的含水量較為適宜，低于11 wt％或高于15 wt％，都會導致難以成球。纖維素濃度影響結果顯示，隨著纖維素濃度加大，溶解時間延長，而且由于黏度過大，同樣會導致

11、難以成球。在分散體系控制中，油相與纖維素溶液的比例，分散劑的選擇以及攪拌速度是三個重要影響因素。當轉速過大或油相過少是，纖維素液滴的碰撞機率加大，不利于成球。對于冷卻過程控制的研究發(fā)現(xiàn)，NMMO在該過程中起主導作用。綜合以上研究，確定了最終優(yōu)化操作條件為:105℃，30 min進行溶解反應;纖維素/NMMO/水混合溶液的含水量為11～15 wt％;纖維素濃度為4％ w/w;分散體系油相比例為3～6，轉速700～1000rpm，分散劑使用

12、4％ w/w Tween80;冷卻過程為每20 min下降5℃，下降范圍為105℃至10℃。按照此條件，最終制得了具有良好的球形度、合適粒徑分布的復合微球，經(jīng)篩分得到了粒徑較大的Cell-TuC-N-L微球和粒徑較小的Cell-TuC-N-S微球，濕真密度約1.6～1.7g/mL，含水率48～53％，孔隙率80～90％，孔容分別為1.05～1.13mL/g(Cell-TuC-N-L)和0.92～1.08 ml/g Cell-TuC-N-

13、S），孔道半徑為72～91nm，比表面積為17.64～23.25 m2/mL。與傳統(tǒng)的纖維素黃酸酯化法相比，本論文所采用的NMMO直接溶解纖維素新方法具有更好的環(huán)境友好性，可以節(jié)省制備時間，顯示出規(guī)模化制備的應用潛力。
　　(2)擴張床作為一種新型的生物分離技術，穩(wěn)定的膨脹床層對該技術的吸附性能和分離效率有重要影響。因此考察制備的新介質在擴張床中的膨脹性能以及床層擴散程度對評價該介質是否適合作為擴張床介質是必要的。衡量床層擴散程度

14、的參數(shù)主要包括:理論塔板數(shù)(N)、理論塔板高度(HETP)、Bo準數(shù)，和軸向擴散系數(shù)。前兩者來源于與流化床相似的理論塔板數(shù)模型，后兩者來源于軸向擴散模型。4個參數(shù)都基于停留時間分布(RTD)實驗的結果計算獲得。N和HETP對床層軸向擴散的描述簡單直觀，N越大，HETP越小，床層軸向擴散程度越小;對于Bo準數(shù)而言，一般認為當Bo大于40時，可以認為液相近似為平推流，軸向擴散程度低。而對于Dax而言，當數(shù)值位于10-5 m2/s水平或以下時

15、，可以認為床層穩(wěn)定，軸向擴散程度低。通過4個參數(shù)的測定，可以獲得擴張床床層軸向擴散程度較為準確的認識，評價介質用于擴張床操作的潛力。
　　對于本文制備的纖維素-碳化鎢復合微球Cell-TuC-N-S，膨脹特性結果顯示，Cell-TuC-N-S具有良好的膨脹性能，膨脹率隨著流速增加而增加。在膨脹率2～3范圍內，操作流速可高達1100～1800 cm/h，與常見的商業(yè)化擴張床吸附基質Streamline系列（200～400 cm/h）

16、和Streamline Direct（400～800 cm/h）相比，在提高操作流速上具有顯著的優(yōu)勢。同時測定了軸向擴散性能，實驗結果顯示，隨著流速增加，理論塔板數(shù)和理論塔板高度分別發(fā)生一定程度的下降與上升，說明流速提升會增加軸向擴散程度。Bo準數(shù)的測定顯示，隨著流速上升，Bo準數(shù)僅從127下降到94，明顯高于床層穩(wěn)定的40;而各流速條件下，軸向擴散系數(shù)Dax數(shù)值維持在10-5 m2/s水平，說明Cell-TuC-N-S擴張床在總體上處

17、于穩(wěn)定狀態(tài)，其軸向擴散程度較低，適合用于高流速條件的擴張床操作。
　　(3)抗體作為重要的生物產(chǎn)品，已經(jīng)成為的分離純化技術的典型對象。目前用于抗體分離純化的手段主要為Protein A親和層析。該技術擁有出色的選擇特異性，可以實現(xiàn)抗體高效高純度的分離純化。但Protein A親和層析也有其不足之處，比如高昂的成本，苛刻的洗脫條件等。為此，近年來研究者開發(fā)了多種新型的分離技術，希望能夠改善和彌補Protein A親和層析的不足。疏水

18、性電荷誘導層析(HCIC)就是一種新型的層析技術，它的配基可以將多種作用力結合在一起（通常為疏水作用和靜電作用），其吸附作用呈現(xiàn)pH依賴性。即在中性條件下，HCIC的配基不帶電荷，以疏水作用吸附目標蛋白;在酸性條件下，HCIC的配基和目標蛋白帶有相同電荷，從而產(chǎn)生靜電排斥力，解吸蛋白。因為獨特的吸附原理，HCIC成為一種非常有潛力的抗體分離技術。
　　本文采用二乙烯砜活化了制備得到的Cell-TuC-N-S基質，偶聯(lián)上了新型的HC

19、IC配基2-巰基咪唑(MI)，制備成具有疏水性電荷誘導層析基團的Cell-TuC-N-S-DVS-MI介質，并考察抗體IgG在該介質上的吸附行為。制備原理如圖2所示。
　　首先對制備的活化過程進行優(yōu)化，考察了二乙烯砜用量、pH和反應時間對活化過程的影響。在考察二乙烯砜用量影響時表明，隨著用量增加，基質活化密度上升，在用量比例達到0.6～0.8后，活化密度趨于穩(wěn)定;在研究pH對活化的影響發(fā)現(xiàn)，活化密度在pH11時到達最大值;而反應時

20、間影響結果顯示，在反應進行3h后，基質活化密度不再上升，說明此時反應趨于飽和。綜上考察結果，確定了活化反應條件為二乙烯砜用量比例1.0，pH11，反應時間4h，由此獲得了Cell-TuC-N-S-DVS的活化密度為100μmol/mL的基質。在對該基質活化的基礎上，偶聯(lián)上配基MI。本文以3倍于活化基團的MI的摩爾比例用量進行反應，偶聯(lián)上所要的配基MI，制得的Cell-TuC-N-S-DVS-MI的配基密度為60μmol/mL介質。采用新

21、制備的Cell-TuC-N-S-DVS-MI進行了抗體吸附試驗，以IgG為模型蛋白，測定了其靜態(tài)吸附平衡數(shù)據(jù)，考察了新介質的蛋白吸附行為。結果發(fā)現(xiàn)，IgG吸附受pH影響顯著，合適吸附pH值為7.0和8.0，飽和吸附容量Qm分別達到77.68和78.02 mg/mL介質;當pH下降至4.0時，IgG吸附容量顯著下降。分析了pH值影響的主要原因，當pH處于IgG的等電點和配基的pKa以下時，IgG和配基之間存在靜電排斥作用，導致蛋白質的解吸

22、，符合HCIC的典型特征。
　　(4)IgG是一種分子量為150 kDa左右的大生物分子，pI值為6～8左右，包含兩條重鏈與兩條輕鏈，分別為50 kDa和25 kDa。IgG是免疫系統(tǒng)中最重要的一類抗體，廣泛存在于血清和組織液中，有超過一半的抗體屬于IgG。因此，IgG產(chǎn)品擁有非常高的應用和研究價值。如果采用傳統(tǒng)的沉淀或過濾方法分離IgG，獲得的IgG純度較低，活性也較差，限制了IgG的應用。而在Protein A親和層析分離Ig

23、G時，需要采用過酸的溶液進行洗脫，容易破壞IgG的活性。而文獻以及我們實驗室前期的研究表明，HCIC層析是一項非常有潛力的抗體分離手段，如商業(yè)化HCIC介質MEP HyperCel已經(jīng)成功應用于抗體的分離。本文中制備的新型HCIC介質Cell-TuC-N-S-DVS-MI也顯示了對IgG分離的潛力。
　　為了證明新型介質Cell-TuC-N-S-DVS-MI分離抗體的可行性，以豬血漿中IgG作為分離對象，基于前期靜態(tài)平衡吸附實驗結

24、果，采用固定床層析進行分離。血漿料液以pH7.0上樣，在酸性條件下進行洗脫，考察了洗脫液pH的影響，pH的范圍為4.0、3.6、3.4和3.0，同時比較了用硫酸銨進行前處理后對分離效果的影響。結果顯示，大部分雜質可在穿透階段流出，采用pH4.0～3.0條件下洗脫，IgG純度可達80％以上，pH3.6洗脫可獲得最大純度為89.4％，純化因子為3.35。其層析結果和電泳結果見圖3。用硫酸銨對原料進行前處理后，可以顯著提升IgG的回收純度。其

25、主要原因在于，高鹽濃度會破壞蛋白質的表面水化層，增強了配基與IgG之間的疏水作用。以上結果表明，以MI為功能配基的新型HCIC介質可以從復雜的血漿料液中高效分離IgG，具有潛在的應用前景。
　　本文還嘗試了將介質Cell-TuC-N-S-DVS-MI用于擴張床吸附分離血漿料液中IgG。實驗中發(fā)現(xiàn)，所制備的介質比較容易發(fā)生破碎，導致碳化鎢泄漏。這一現(xiàn)象的原因分析認為，一是操作流速過高，二是介質的機械強度不足。介質機械強度發(fā)生下降可能

26、是由于活化與偶聯(lián)過程導致纖維素基質結構發(fā)生變化。
　　總之，本論文圍繞新型纖維素復合基質的制備、功能化以及蛋白分離應用，展開了系統(tǒng)研究，獲得了一些有價值的結果，為新型介質開發(fā)和抗體分離純化提供一定的指導。
　　基于本文工作，后續(xù)可以從以下幾個方面進行進一步的研究:
　　(1)雖然NMMO是一類非衍生溶劑，具有良好的環(huán)境友好特性，但是在本文研究過程中發(fā)現(xiàn)，NMMO可能造成纖維素氧化以及結構改變，不利于基質后期偶聯(lián)配基反應

27、。所以需要進一步尋找其他更合適的溶劑，用于溶解纖維素。
　　(2)對于纖維素球的制備而言，冷卻過程的控制非常重要。本文中考察并優(yōu)化的制備條件仍然有限，需要對更多的溶劑和再生方法進行嘗試，從而進一步改善纖維素球的制備過程。
　　(3)SDS-PAGE結果顯示IgG的洗脫峰中仍然殘留一定數(shù)量的白蛋白與纖維蛋白原，影響了IgG的純度，所以有必要進一步改進IgG的分離純化過程?？梢酝ㄟ^增加膜過濾等前處理手段進行改善。
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