東南景天鎘超積累相關基因的克隆與功能研究.pdf

1、超積累生態(tài)型東南景天是在中國本土發(fā)現(xiàn)的Zn/Cd超積累植物，是植物修復的良好材料。本研究利用cDNA-AFLP技術分析了超積累生態(tài)型東南景天鎘耐性或積累相關的基因；利用轉基因技術分析了兩個光合作用相關基因與鎘耐性或積累的關系；同時利用RACE技術分離得到了三個金屬離子轉運子，并利用酵母功能互補、實時熒光定量PCR和轉基因等技術研究了三個轉運子的功能。主要結果如下：
　　 1、利用cDNA-AFLP技術(cDNA擴增片段長度多態(tài)性

2、：cDNA-amplified fragmentlength polymorphism)分析比較了超積累生態(tài)型和非超積累生態(tài)型東南景天在鎘處理下的基因表達差異。采用水培條件，超積累生態(tài)型和非超積累生態(tài)型東南景天的鎘處理濃度分別為100μM和2μM；處理時間為24小時和8天，不加鎘處理的植物作為對照；通過cDNA-AFLP分析，從超積累生態(tài)型東南景天中分離得到了58個與非超積累生態(tài)型東南景天有差異的基因片段。分離得到的基因片段與GenBa

3、nk數(shù)據(jù)庫里TDFs(transcript-derived fragments)進行同源性比對，其中31個TDFs與功能已知的基因有顯著的同源性；6個TDFs與功能未知的基因有明顯的同源性；其余21個TDFs與數(shù)據(jù)庫中的基因沒有明顯的同源性。31個與功能已知的基因有顯著同源性的TDFs按照功能可以分為脅迫響應、細胞代謝和組成、光合作用相關、轉運相關、表達調控、轉錄因子和蛋白結合7大類。另外，在這些分離得到的58個TDFs中，有37個基因

4、片段在鎘處理下表達量是下調的，其余21個基因片段在鎘處理下表達量是上調的。
　　 2、本試驗采用水培條件，測定了鎘對兩種生態(tài)型東南景天的葉綠素熒光參數(shù)和PsbS基因表達水平的影響，同時分析了超積累生態(tài)型東南景天的PsbS基因(SaPsbS)與鎘耐性、積累的關系。結果表明，2μM鎘處理8天后，非超積累生態(tài)型東南景天的Fv/Fm值和NPQ值顯著降低；超積累生態(tài)型東南景天的Fv/Fm值沒有發(fā)生變化，NPQ值顯著增加；此外，兩種生態(tài)型東

5、南景天的PsbS(photosystemⅡ subunit S)基因的表達量都上調了2倍左右。超表達超積累生態(tài)型東南景天的PsbS(SaPsbS)基因能夠顯著促進煙草的生長；在100μM鎘處理條件下，轉基因煙草的生物量比野生型煙草的高出7％-28％，而且轉基因煙草的NPQ值顯著高于野生型煙草；超表達SaPsbS能夠顯著增加煙草地上部的鎘積累量。
　　 3、本試驗采用水培條件，分析了鋅/鎘處理對兩種生態(tài)型東南景天的Lhcb2基因表

6、達水平的影響，并進一步研究了超積累生態(tài)型東南景天的Lhcb2(SaLhcb2)基因與鎘積累和耐性的關系。結果表明，不同濃度的鋅(50，500，2000μM)、鎘(2.20.200μM)處理顯著增加了兩種生態(tài)型東南景天的Lhcb2基因的表達量。在短時間處理(24小時)下，超積累生態(tài)型東南景天的基因上調倍數(shù)大于非超積累生態(tài)型植物；而在長時間處理條件下，非超積累生態(tài)型植物的基因上調倍數(shù)要大于超積累生態(tài)型的。超表達超積累生態(tài)型植物的Lhcb2(

7、SaLhcb2)基因能夠顯著促進煙草的生長，在不加鎘條件下，轉基因煙草的地上部生物量比野生型煙草的生物量高出14％-41％，根系的生物量可以高出21％-57％；在加鎘處理下，轉基因煙草的地上部生物量也是高于野生型煙草。此外，有四個轉基因株系地上部的鎘積累量比野生型的高出6％-35％，說明超表達SaLhcb2能夠促進煙草的生長以及煙草對鎘的積累量。
　　 4、P1B-type ATPases(HMs，heavy metal ATP

8、ases)屬于P-type ATPases，是一類具有轉運重金屬離子的轉運子，其中的HMA2、HMA3和HMA4具有轉運鋅、鎘、鉛的功能。根據(jù)不同物種間的序列同源性設計兼并引物，并利用RACE技術分離得到了超積累生態(tài)型和非超積累生態(tài)型東南景天的HMA2基因(分別命名為SaHMA2和SnHMA2)。利用洋蔥表皮細胞分析基因亞細胞定位的結果表明，SaHMA2和SnHMA2基因是細胞質膜上的轉運子。酵母功能互補實驗結果表明，SaHMA2能夠增

9、強鋅/鎘突變體△zrc1對鋅、鎘的耐性，而且SaHMA2轉運鋅、鎘的能力顯著大于SnHMA2；表達SaHMA2或SnHMA2的酵母的鋅、鎘含量顯著低于表達空載體的酵母。在植物體內，超積累生態(tài)型東南景天根系的HMA2基因表達量是非超積累植物的5倍，地上部HMA2基因的表達量是非超積累植物的13倍。超積累生態(tài)型東南景天根系的HMA2在添加鋅、鎘處理時表達量上調，而非超積累生態(tài)型根系的基因表達量在添加鎘處理時下調，添加鋅處理時上調。此外，轉基

10、因結果表明，超表達SaHMA2后煙草地上部的鎘和鋅含量都是野生型的1.6倍，根系的鎘含量和鋅含量是野生型的66％和44％；超表達SnHMA2的煙草根系的鎘含量顯著低于野生型的，但是地上部的鎘/鋅含量沒有顯著增加。以上結果表明，SaHMA2基因的鋅/鎘轉運能力大于SnHMA2基因，而且SaHMA2基因的表達量顯著高于SnHMA2，SaHMA2基因應該是超積累生態(tài)型東南景天能夠高效地往地上部轉運鋅/鎘的主要原因之一。
　　 5、金屬

11、耐性蛋白(Metal tolerance protein，MTP1)是CDF(cation diffusionfacilitator)家族的重要成員，是液泡膜上負責往液泡中轉運Zn的轉運子。本試驗利用RACE技術從超積累生態(tài)型和非超積累生態(tài)型東南景天中分離得到了兩個編碼金屬耐性蛋白的基因(MTP1)，命名為SaMTP1和SnMTP1。酵母功能互補實驗結果表明，SaMTP1和SnMTP1能夠增強△zrc1酵母突變體對鋅的耐性，而且SaMT

12、P1和SnMTP1的轉運能力基本相同?；騺喖毎ㄎ坏慕Y果表明，SaMTP1和SnMTP1是分布在植物細胞液泡膜上的轉運子。在植物體內，超積累生態(tài)型東南景天地上部的MTP1基因的表達量是非超積累生態(tài)型的88倍左右，根系的基因表達量是非超積累植物的10倍。在添加鋅處理時，超積累生態(tài)型植物地上部的基因表達量上調了1倍，根系的基因表達量沒有顯著性變化；而非超積累生態(tài)型植物根系的MTP1基因表達量上調了1倍，地上部的基因表達量沒有顯著變化。在添

13、加鎘處理時，超積累生態(tài)型和非超積累生態(tài)型植物地上部的基因表達量都有下調。轉基因植物的分析結果表明，超表達SaMTP1或SnMTP1能夠顯著增加煙草根系和地上部的的鋅含量，轉基因植物SaM2(超表達SaMTP1)和SnM1(超表達SnMTP1)根系的鋅含量分別是野生型煙草的3.4倍和2.6倍；而地上部的鋅含量分別是野生型的1.5倍和1.4倍。本研究的結果表明，SaMTP1基因應該是超積累生態(tài)型東南景天耐受和積累鋅的重要基因之一。
　

14、　 6、CAXs是Ca2+/cation反向轉運子，AtCAX2和AtCAX4具有轉運鎘離子的能力，負責將Cd轉運進入液泡。本試驗還從兩種超積累生態(tài)型和非超積累東南景天中分離得到了編碼CAX2轉運子的基因，分別命名為SaCAX2和SnCAX2，兩個基因編碼的蛋白的氨基酸序列有96％的同源性。酵母功能互補實驗的結果表明SaCAX2和SnCAX2都能夠轉運鈣離子，而且SaCAX2的轉運能力要低于SnCAX2。在植物體內，兩種生態(tài)型東南景天

15、的CAX2基因的表達量在對照情況下沒有顯著性差異，而兩個基因對Zn/Cd的響應卻不一樣。對于超積累生態(tài)型植物，根系的基因表達量在Zn/Cd處理時都有所下調，地上部的表達量在添加鎘處理時上調而在添加鋅處理時下調。對于非超積累生態(tài)型東南景天，地上部和根系的基因表達量在添加鋅處理時都沒有顯著性差異；而在添加鎘處理時，根系的基因表達量上調而地上部的表達量是下調的。轉基因植物的分析結果表明，超表達SaCAX2(SaC9)或SnCAX2(SnC7)