USP18在IFN-α抗乙肝病毒機制中的作用及調(diào)控研究.pdf

1、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是一個世界性的問題。盡管有效的乙肝疫苗已在臨床上廣泛運用。慢性HBV感染能夠?qū)е赂斡不透渭毎伟┑任：乐氐慕K末期肝病。雖然近年來有多種抗HBV藥物不斷涌現(xiàn)，但α干擾素（IFN-α）是目前治療慢性HBV感染的首選藥物之一，其具有療程固定、停藥后復(fù)發(fā)率低、部分患者可出現(xiàn)HBsAg陰轉(zhuǎn)而獲得“徹底治愈”等優(yōu)點。長效聚乙二醇干擾素還具有用藥間隔時間長、副作用相對較少等優(yōu)點。但目前

2、仍面臨著價格昂貴和相當一部分患者的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率低等問題。IFN-α應(yīng)答率低的具體分子機制仍不十分明確，有待進一步研究。在前期的工作當中我們發(fā)現(xiàn)慢乙肝患者IFN-α治療前應(yīng)答組和無應(yīng)答組肝細胞中存在大量差異表達的基因。其中干擾素刺激基因USP18和ISG15位于同一信號通路，USP18在治療前在無應(yīng)答組中高表達，提示其可能與IFN-α抗HBV的活性相關(guān)，HBV可能調(diào)控宿主細胞中USP18的表達，進而改變IFN-α的抗病毒活性。

3、　　目的：
　　1.HBV感染肝癌細胞對USP18表達的影響。
　　2.構(gòu)建shRNA-USP18慢病毒載體，研究其對Hepg2.2.15細胞內(nèi)HBV復(fù)制能力的影響。
　　3.研究shRNA-USP18慢病毒載體在不同濃度IFN-α作用下對HBV復(fù)制能力的影響。
　　4.研究shRNA-USP18慢病毒載體是否是通過調(diào)控JAK/STAT信號通路調(diào)節(jié)IFN-α的抗HBV作用。
　　5.利用生物信息學(xué)初步分析H

4、epg2.2.15-shRNA-USP18細胞中的差異表達基因及相關(guān)信號通路。
　　方法：
　　1.利用實時熒光定量PCR分析不同肝癌細胞系中USP18 mRNA的表達水平。轉(zhuǎn)染HBV表達質(zhì)粒，利用實時熒光定量PCR、Western blot及雙熒光素酶實驗檢測HBV感染對USP18 mRNA、蛋白及啟動子活性的影響。
　　2.構(gòu)建shRNA-USP18慢病毒載體，利用實時熒光定量PCR篩選出干擾效率最佳的慢病毒載體，

5、并篩選出穩(wěn)定細胞株。利用實時熒光定量PCR、Western blot驗證Hepg2.2.15-shRNA-USP18細胞中對USP18的干擾效率。
　　3.利用定量PCR檢測干擾USP18表達對Hepg2.2.15細胞中HBV DNA、pgRNA和total RNA復(fù)制的影響。利用ELISA檢測干擾USP18對Hepg2.2.15細胞中HBsAg和HBeAg分泌的影響。利用熒光定量PCR檢測過表達USP18對Hepg2.2.15細

6、胞中HBV DNA、pgRNA和total RNA復(fù)制的影響。利用ELISA檢測過表達USP18對Hepg2.2.15細胞中HBsAg和HBeAg分泌的影響。
　　4.利用熒光定量PCR檢測干擾USP18表達后IFN-α對Hepg2.2.15細胞中HBV復(fù)制的影響。利用ELISA檢測干擾USP18表達后IFN-α對Hepg2.2.15細胞中HBsAg和HBeAg分泌的影響。利用Western blot檢測干擾USP18表達后IFN

7、-α對Hepg2.2.15細胞中HBcAg生成的影響。
　　5.利用熒光定量PCR檢測干擾USP18表達后IFN-α對Hepg2.2.15細胞中JAK/STAT下游的干擾素刺激基因ISG15、MxA和IFIT1 mRNA的影響。利用Western blot檢測干擾USP18表達后IFN-α對Hepg2.2.15細胞中JAK/STAT下游的干擾素刺激基因ISG15、MxA和IFIT1蛋白的影響。利用Western blot檢測干擾U

8、SP18表達后IFN-α對Hepg2.2.15細胞中JAK/STAT信號通路中磷酸化STAT1及STAT1總蛋白表達的影響。利用Western blot檢測干擾USP18表達后IFN-α處理不同時間點及不同加藥方式對 Hepg2.2.15細胞中 JAK/STAT信號通路中磷酸化STAT1及STAT1總蛋白表達的影響。
　　6.利用基因芯片檢測干擾USP18表達后Hepg2.2.15細胞中差異表達的基因，并利用公共數(shù)據(jù)庫及相關(guān)軟件對

9、差異表達的基因進行生物信息學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.Hepg2.2.15細胞中USP18的表達水平較其他肝癌細胞中的表達高，HBV明顯促進宿主細胞中USP18的表達，選擇HepG2和Hepg2.2.15細胞用于后續(xù)實驗。HBV感染能夠促進HepG2細胞中USP18 mRNA和蛋白的表達，并能增強其啟動子活性。
　　2.針對USP18篩選出干擾效率最佳的慢病毒載體并構(gòu)建穩(wěn)定細胞株Hepg2.2.15-shRNA-US

10、P18。Hepg2.2.15-shRNA-USP18細胞中USP18 mRNA和蛋白的表達受到明顯抑制。
　　3.干擾USP18表達后Hepg2.2.15細胞中HBV DNA、pgRNA和total RNA的復(fù)制受到明顯抑制。Hepg2.2.15細胞中HBsAg和HBeAg的分泌受到明顯抑制。過表達USP18后Hepg2.2.15細胞中HBV DNA、pgRNA和 total RNA的復(fù)制明顯增強。Hepg2.2.15細胞中 HB

11、sAg和HBeAg的分泌明顯增強。
　　4.干擾USP18表達后IFN-α對Hepg2.2.15細胞中HBV DNA、pgRNA和 total RNA復(fù)制的抑制作用明顯增強。干擾USP18表達后IFN-α對Hepg2.2.15細胞中HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用明顯增強。干擾USP18表達后IFN-α對Hepg2.2.15細胞中HBcAg生成的抑制作用明顯增強，且在IFN-α不同濃度組中均有明顯的抑制作用。
　　5.干

12、擾USP18表達后IFN-α對Hepg2.2.15細胞中JAK/STAT下游的干擾素刺激基因ISG15、MxA和IFIT1 mRNA和蛋白的誘導(dǎo)作用明顯增強。干擾USP18表達后IFN-α對Hepg2.2.15細胞中JAK/STAT信號通路中磷酸化STAT1表達的誘導(dǎo)作用明顯增強。干擾USP18表達后IFN-α處理不同時間點，Hepg2.2.15細胞中JAK/STAT信號通路中磷酸化 STAT1表達明顯增強。不同加藥方式下干擾USP18

13、表達后Hepg2.2.15細胞中JAK/STAT信號通路中磷酸化STAT1表達明顯增強。
　　6.初步篩選出干擾USP18后Hepg2.2.15細胞中差異表達的基因及相關(guān)的生物學(xué)功能和信號通路。
　　結(jié)論：
　　1.肝癌細胞HepG2中HBV感染可促進USP18的表達并增強USP18啟動子的活性。
　　2.干擾USP18表達后Hepg2.2.15細胞中HBV的復(fù)制和分泌受到明顯抑制。
　　3.干擾USP18