人促甲狀腺激素受體抗體定量熒光酶免法的建立及臨床應用.pdf

1、自身免疫性甲狀腺病(autoimmune thyroid disease，AITD)是一類多發(fā)病，包括Graves病(Graves’disease，GD)、橋本甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis，HT)等。GD是甲狀腺毒癥最常見類型，促甲狀腺激素受體(TSH receptor，TSHR)是GD的主要抗原，在病理條件下可刺激機體產生TSHR抗體(thyrotropinreceptor antibody，TRAb)，T

2、RAb包括甲狀腺刺激性抗體(thyroid stimulatingantibody，TSAb)、甲狀腺刺激阻斷性抗體(thyroid stimulating blocking antibody，TSBAb)和中性抗體等自身抗體。其中TSAb可刺激甲狀腺激素分泌增多致甲亢。TSAb是GD的主要病因，對GD的發(fā)生發(fā)展起重要作用。TSHR分膜外區(qū)(TSHR-ecd)、跨膜區(qū)和膜內區(qū)，TRAb結合位點主要分布在TSHR-ecd，研究表明TSAb

3、的抗原表位主要分布于TSHR-ecd的氨基端(TSHRn)。本室在研究TSHR抗原決定簇分布的基礎上，將TSHR-ecd分段表達，進行了抗原決定簇分布的篩選，在TSHR-ecd氨基端篩選出主要與TSAb結合的抗原決定簇相對集中的基因片段(TSHRn462bp)，并進行原核表達，獲得了能與TSAb結合的該基因片段編碼的融合蛋白，即硫氧還蛋白-人促甲狀腺激素受體膜外區(qū)氨基端片段蛋白(TrxFus-hTSHRn)，為建立TRAb(以TSAb為

4、主)檢測技術奠定了基礎。
　　 熒光酶免疫分析技術(fluorescent-enzyme immunoassay，F(xiàn)EIA)是在酶聯(lián)免疫分析技術(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)基礎上，通過測定酶催化熒光底物發(fā)出的熒光強度而建立的一種定量檢測超微量物質的熒光酶免疫分析技術，其比ELISA更靈敏、測量范圍更寬。
　　 本研究以重組TrxFus-hTSHRn為抗原，建立定量檢測

5、人血清TRAb(以TSAb為主)FEIA，并應用于臨床，為AITD的診療提供依據。
　　 目的：
　　 應用基因工程技術原核表達hTSHR膜外區(qū)氨基端片段基因，獲取TrxFus-hTSHRn融合蛋白，以此為抗原建立定量人血清TRAb(以TSAb為主)FEIA，并應用于臨床，探討其對AITD特別是GD的診斷、鑒別診斷、療效監(jiān)測和預后的臨床價值。
　　 方法：
　　 1.人TSHR膜外區(qū)氨基端融合蛋白(Trx

6、Fus-hTSHRn)原核表達、純化及鑒定。
　　 將本室構建的hTSHRn-ecd重組表達質粒pET102/D-hTSHRn462bp轉入表達工程菌E.Coli BL21 StarTM(DE3)，誘導表達目的蛋白，經變性Ni2+-NTA(鎳-氮川乙酸)親和層析純化，梯度透析復性、濃縮，獲得重組TrxFus-hTSHRn，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定其分子量，蛋白免疫印跡(Western blot

7、ting)鑒定免疫活性。
　　 2.以TrxFus-hTSHRn為抗原建立定量人血清TRAb(以TSAb為主)FEIA及方法學鑒定。
　　 將重組融合蛋白TrxFus-hTSHRn包被聚苯乙烯96孔板，以待測樣品血清中TRAb為第一抗體，以本室制備的TRAb校準品(WHO推薦的TRAb參考制劑(WHO NIBSC90/672)的“二次校準物”)建立標準曲線，堿性磷酸酶標記的羊抗人IgG為第二抗體，4-甲基磷酸傘形酮(4-

8、MUP)為熒光底物建立定量人血清TRAb(以TSAb為主)FEIA。最佳實驗條件的探索：(1)抗原包被量(2)待測樣品血清稀釋度(3)熒光底物稀釋度(4)熒光底物反應時間(5)反應終止液作用時間等因素組合后做交叉試驗，確定最佳實驗條件。鑒定該法靈敏度、特異性、精密度、準確度、健全性、相關性等指標。檢測167例正常人血清樣品(均為男性，年齡19-28歲(22.6±2.7))，確立陽性切點值(cut-off point value)。

9、>　　 3.定量人血清TRAb(以TSAb為主)FEIA的臨床應用。
　　 檢測6種甲狀腺疾病患者559例，分為8組①Graves'病(GD)甲亢初發(fā)組：183例(男81例，女102例，年齡18-70歲(40.6±11.2))；②GD治療3-9個月組：56例(男20例，女36例，年齡28-68歲(39.6±11.0))；③GD治療1年組：64例(男33例，女31例，年齡32-65歲(42.1±13.9))，④橋本甲狀腺炎(HT

10、)初發(fā)伴甲減組：112例(男39例，女73例，年齡24-79歲(44.5±13.1))；⑤單純性甲狀腺腫大組：22例(男8例，女14例，年齡19-67歲(42.0±13.1))；⑥結節(jié)性甲狀腺腫組：49例(男28例，女21例，年齡22-60歲(31.0±12.5))；⑦臨床診斷甲狀腺腺瘤組：21例(男10例，女11例，年齡17-68歲(38.7±12.4))；⑧亞急性甲狀腺炎組：52例(男24例，女28例，年齡21-66歲(45.0±9

11、.0))。
　　 4.統(tǒng)計方法。
　　 人血清TRAb(以TSAb為主)測定濃度(mIU/L)以“均數±標準差”(x±s)表示。組間比較采用方差分析(ANOVA)，各組陽性率比較采用卡方檢驗(x2檢驗)。變量間相關分析采用直線相關分析和一致性檢驗(kappa分析)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1.人TSHR膜外區(qū)氨基端融合蛋白(TrxFus-hTSHRn)原核表達、純化及鑒定。<

12、br>　　 含重組表達質粒pET102/D-hTSHRn462bp的表達工程菌E.Coli BL21 StarTM(DE3)在2×YT培養(yǎng)基中37℃過夜搖菌(200rpm)培養(yǎng)，以異丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thoiglactoside，IPTG)為誘導劑，終濃度1mM，37℃誘導4小時，產物在變性條件下Ni2+-NTA親和層析純化，梯度透析復性、濃縮，獲得重組融合蛋白TrxFus-hTSHRn，經SDS-P

13、AGE測定TrxFus-hTSHRn分子量約為37.5KD，純度約91.2％，考馬斯亮藍(CBG)法定量，不同批次生產的融合蛋白產率約為21.5-28.4mg/L培養(yǎng)基，Western Blotting鑒定TrxFus-hTSHRn免疫活性良好。
　　 2.以TrxFus-hTSHRn為抗原建立定量人血清TRAb(以TSAb為主)FEIA及方法學鑒定。
　　 2.1、最佳實驗條件。
　　 TrxFus-hTSHR

14、n抗原包被量100ng/孔，4℃過夜；待測樣品血清稀釋度1：100，37℃溫育60分鐘；堿性磷酸酶標記羊抗人IgG二抗稀釋度1:20000，37℃溫育60分鐘；熒光底物4-MUP稀釋度1:10，37℃避光溫育60分鐘；加反應終止液50mM乙二胺四乙酸(EDTA)，37℃避光溫育5分鐘后在熒光儀上測定相對熒光單位(PFU)計數。
　　 2.2、標準曲線。
　　 以WHO推薦的TRAb參考制劑(WHO NIBSC90/672

15、)的“一次校準物”(Medizym()T.R.A.Calibrators)為標準(對照品)，對本室制備的TRAb校準品進行標定，并結合臨床建立本法的標準曲線，各點濃度分別為(S1-S5)0.07mIU/L，0.22 mIU/L，0.72 mIU/L，4.26 mIU/L，9.68 mIU/L。
　　 2.3、結果計算。
　　 待測樣品血清1:100稀釋后測得的RFU值在標準曲線上對應的濃度值×100(樣品稀釋倍數)即為待

16、測樣品血清的TRAb(以TSAb為主)濃度(mIU/L)。
　　 2.4、方法學鑒定。
　　 ①靈敏度：本法檢測靈敏度0.05mIU/L。
　　 ②特異性：TrxFus-hTSHRn與hTRAb特異性結合，與人甲狀腺過氧化物酶抗體(hTPOAb)無交叉結合反應。
　　 ③精密度：陽性血清、陰性血清批內變異(CV％)(n=6)分別為4.47％和9.25％。批間變異(CV%)(n=8)分別為7.29％和13.

17、57％。
　　 ④準確度：測定高、中、低濃度樣品回收率分別為102.13％、97.50％、98.00％，平均回收率97.46％。
　　 ⑤健全性：將GD甲亢患者血清進行兩次對倍稀釋后做平行實驗，血清樣品稀釋曲線(r=0.9983)與標準曲線(r=0.9979)成平行關系，本法健全性良好。
　　 ⑥相關性：本法與意大利索林(DiaSorin)公司放射受體法(RRA)TRAb檢測試劑盒同檢51例GD患者(不同療程)血

18、清樣品，兩法檢測結果顯著相關(r=0.767，P<0.05；一致性檢驗kappa=0.791，P<0.01)。
　　 2.5、確定陽性切點值。
　　 檢測167例健康男性血清TRAb(以TSAb為主)濃度為(x±s)23.5±9.7mIU/L，以x+2s(單側95％可信區(qū)間)為陽性切點值，即42.9 mIU/L。
　　 3.定量人血清TRAb(以TSAb為主)FEIA的臨床應用。
　　 3.1、6種甲狀腺

19、疾病患者血清TRAb(以TSAb為主)含量(mIU/L)分析。
　　 ①GD初發(fā)組(142.5±23.2)顯著高于其它各組(P均<0.01)。
　　 ②GD治療1年組(75.6±35.0)與GD治療3-9個月組(93.1±30.3)無顯著差別(P>0.05)，這兩組均顯著低于GD初發(fā)組(142.5±23.2)(P均<0.01)，但均仍顯著高于正常人(23.5±9.7)(P均<0.05)。
　　 ③GD治療3-9個

20、月組(93.1±30.3)、GD治療1年組(75.6±35.0)、HT初發(fā)伴甲減組(71.3±14.7)均顯著高于單純性甲狀腺腫組(25.6±12.0)、結節(jié)性甲狀腺腫組(38.7±13.5)、甲狀腺腺瘤組(41.0±8.8)、亞急性甲狀腺炎組(40.3±10.6)(P均<0.05)。
　　 ④單純性甲狀腺腫組、結節(jié)性甲狀腺腫組、甲狀腺腺瘤組、亞急性甲狀腺炎組與正常人無顯著差別(P均>0.05)。
　　 3.2、6種甲狀

21、腺疾病患者血清TRAb(以TSAb為主)陽性率分析。
　　 ①GD初發(fā)甲亢組陽性率(88.94％)高于其它各組(P均<0.01)。
　　 ②GD治療1年組陽性率(38.62％)低于GD治療3-9個月組(64.09％)(P<0.05)，這兩組陽性率均顯著低于GD初發(fā)甲亢組(88.94％)(P均<0.05)，但仍均顯著高于正常人(4.91％)(P均<0.01)。
　　 ③GD治療3-9個月組(64.09％)、GD治療

22、1年組(38.62％)、HT初發(fā)伴甲減組(61.88％)均顯著高于單純性甲狀腺腫組(0.85％)、結節(jié)性甲狀腺腫組(3.71％)、甲狀腺腺瘤組(5.01％)、亞急性甲狀腺炎組(11.69％)(P均<0.05)
　　 ④單純甲腫、甲狀腺腺瘤、結甲腫、亞甲炎組與正常人無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)
　　 結論：
　　 1.重組表達質粒pET102/D-hTSHRn462bp在E.Coli BL21 StarTM(DE

23、3)中高效表達，獲得了能與TSAb結合的hTSHRn-ecd重組融合蛋白TrxFus-hTSHRn，該蛋白純度約91.2％，產率21.5-28.4mg/L培養(yǎng)基，免疫活性好。
　　 2.制備并標定了TRAb校準品，建立了以重組融合蛋白TrxFus-hTSHRn為抗原、以96孔板為固相載體的定量檢測人血清TRAb(以TSAb為主)FEIA。本法靈敏、特異、穩(wěn)定、簡便。
　　 3.本法用于甲狀腺疾病患者臨床觀察，GD甲亢患者