中樞PGE2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)心血管功能的調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、研究目的：
　　高血壓(Hypertension)是一種高發(fā)病率的慢性疾病，導(dǎo)致全身組織器官形成多種嚴(yán)重并發(fā)癥，超過(guò)90％高血壓病人的發(fā)病原因不明。盡管目前已有多種治療手段能明顯降低血壓，但高血壓的并發(fā)癥如心力衰竭和腦卒中等仍高居不下，因此對(duì)高血壓發(fā)生和發(fā)展的基礎(chǔ)研究仍具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。血壓水平主要有體液和神經(jīng)機(jī)制兩個(gè)方面進(jìn)行調(diào)控，神經(jīng)調(diào)控包括交感和迷走神經(jīng)機(jī)制，其中交感神經(jīng)的調(diào)控中樞位于頭端延髓腹外側(cè)區(qū)(Rostral

2、ventrolateral medulla，RVLM)，其接收并整合高位腦干、中樞核團(tuán)(如孤束核(Nucleus tractus solitaries，NTS)、室旁核(Paraventricularnucleus，PVN))及外周感受器傳入的神經(jīng)沖動(dòng)，并通過(guò)前交感神經(jīng)元神經(jīng)纖維傳遞至脊髓中間外側(cè)柱與交感節(jié)前神經(jīng)元發(fā)生單突觸聯(lián)系控制外周的交感神經(jīng)活動(dòng);因此，RVLM是中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)交感輸出及心血管功能的關(guān)鍵中樞。研究表明，RVLM內(nèi)微

3、量注射γ-氨基丁酸，可有效抑制交感功能，降低血壓;電流刺激RVLM內(nèi)神經(jīng)元，可使交感功能活動(dòng)亢進(jìn)，升高血壓。RVLM內(nèi)前交感神經(jīng)元興奮性異常增高是交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)的主要原因;交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)是高血壓的一個(gè)重要發(fā)病機(jī)制，且與多種心血管疾病形成及預(yù)后密切相關(guān)。因此，闡明RVLM內(nèi)前交感神經(jīng)活動(dòng)亢進(jìn)的機(jī)制并探索有效抑制其活性的方法對(duì)預(yù)防及治療高血壓具有深遠(yuǎn)意義。
　　高血壓的形成和發(fā)展及其終末器官損傷與免疫系統(tǒng)紊亂、慢性低度炎癥等多種途

4、徑引起的氧化應(yīng)激密切相關(guān)。當(dāng)活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的生成量增多或清除能力減弱，引起ROS過(guò)量積累，使ROS的生成與清除之間的平衡被打破，形成氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致高血壓的形成，持續(xù)的高血壓狀態(tài)又促進(jìn)氧化應(yīng)激水平升高，形成惡性循環(huán)。ROS主要由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶、線粒體呼吸、

5、過(guò)氧化物酶及一氧化氮合酶等途徑產(chǎn)生，其中NADPH氧化酶是主要途徑;氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)是機(jī)體內(nèi)源性抗氧化防御機(jī)制的主要組成部分，參與ROS的清除、阻斷ROS對(duì)細(xì)胞的損害、修復(fù)由ROS造成的細(xì)胞損傷。研究證實(shí)自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rat，SHR)及血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)灌流的Wistar-Kyoto(WKY)大鼠的R

6、VLM內(nèi)氧化應(yīng)激增強(qiáng)，引起神經(jīng)元活動(dòng)增強(qiáng)，導(dǎo)致腎交感神經(jīng)活動(dòng)(Renal sympathetic nerve activity，RSNA)亢進(jìn)，血壓升高。在SHR的RVLM內(nèi)微量注射SOD的模擬劑Tempol降低ROS水平和有效降低血壓。
　　免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)為ROS生成的重要途徑之一且持續(xù)慢性低度炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致過(guò)量的ROS產(chǎn)生，促進(jìn)高血壓的形成及終末器官損傷。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌的PGE2是一種重要的炎癥因

7、子，通過(guò)自分泌及旁分泌的方式作用影響神經(jīng)元的功能。前列腺素類(lèi)(Prostaglandins，PGs)具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，在心血管功能調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中環(huán)氧合酶(Cyclooxygenase，COX)是PGEs生成的限速酶。研究發(fā)現(xiàn)，COX/PGEs軸在高血壓形成與發(fā)展過(guò)程中具有重要作用，并介導(dǎo)高血壓引起的終末器官損傷過(guò)程;大鼠腦室內(nèi)(Intracerebroventricular，ICV)灌流前列腺素E2(Prostagla

8、ndin E2，PGE2)或者室旁核(Paraventricular nucleus，PVN)內(nèi)微量注射PGE2可增強(qiáng)RSNA及升高血壓，而其它亞型的PGs并不參與心血管活動(dòng)的中樞調(diào)控機(jī)制。
　　然而，RVLM作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)交感輸出及心血管功能的最后樞紐，但PGE2在RVLM內(nèi)的含量變化以及是否參與心血管功能的調(diào)節(jié)均尚不明確，而且中樞PGE2與氧化應(yīng)激是否存在聯(lián)系仍有待驗(yàn)證。因此，本研究的總體目標(biāo)是明確中樞PGE2在RVLM

9、內(nèi)對(duì)心血管功能調(diào)控的作用，并探討其作用是否通過(guò)氧化應(yīng)激增強(qiáng)所介導(dǎo)。因此，闡明PGE2在RVLM內(nèi)對(duì)心血管功能的影響并探索其調(diào)控機(jī)制對(duì)高血壓的發(fā)病機(jī)制研究至關(guān)重要，從而為高血壓的預(yù)防與治療提供新的思路。
　　研究方法：
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性16周SHR和腦室(Intraventricular，ICV)內(nèi)灌流AngⅡ(24μg/d)7天的280-320g Sprague-Dawley(SD)大鼠，經(jīng)股動(dòng)脈穿刺測(cè)量平均動(dòng)脈壓(Mea

10、narterial pressure，MAP)和心率(Heart rate，HR);酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA) RVLM內(nèi)PGE2含量;Western Blot檢測(cè)RVLM內(nèi)COX亞型的蛋白表達(dá)量。
　　整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察SD大鼠RVLM內(nèi)微量注射PGE2對(duì)大鼠MAP、HR及RSNA的影響;以及預(yù)處理Tempol后，PGE2對(duì)心血管效應(yīng)的影響。每側(cè)RVLM選擇3個(gè)

11、位點(diǎn)微量注射PGE2，采用DHE檢測(cè)ROS含量，Western Blot檢測(cè)NOX及SOD的蛋白表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　一、中樞PGE2對(duì)大鼠心血管功能的調(diào)節(jié)作用
　　1、高血壓狀態(tài)下RVLM內(nèi)PGE2含量明顯升高
　　SHR組MAP顯著高于WKY組:（157.8±4.9 vs.118.0±7.1 mmHg，p＜0.05，n=5），SHR組RVLM內(nèi)PGE2含量顯著高于WKY組(0.25±0.01 vs.0.

12、17±0.01μg/mg，P＜0.05，n=5)。中樞灌注AngⅡ組的MAP顯著高于aCSF組:（154.3±6.92 vs.113.3±3.57 mmHg，P＜0.05，n=4)，AngⅡ組RVLM內(nèi)PGE2含量顯著高于aCSF組(0.26±0.01 VS.0.15±0.01μg/mg，P＜0.05，n=4)。結(jié)果表明:高血壓狀態(tài)下，RVLM內(nèi)PGE2含量升高。
　　2、RVLM內(nèi)微量注射PGE2增加血壓和交感神經(jīng)活動(dòng)
　

13、　MAP變化值:aCSF組（2.25±0.49 mmHg）、0.3 pmol PGE2組（11.75±1.93 mmHg）、3 pmol PGE2組（24.25±3.43 mmHg）和30 pmoL PGE2組（13.75±1.38 mmHg）;RSNA變化值:aCSF組（2.25±0.63％）、0.3 pmol PGE2組（12.75±2.29％）、3 pmol PGE2組（24.25±3.43％）和30 pmol PGE2組（14.

14、25±1.89％）。結(jié)果表明:RVLM內(nèi)微量注射0.3-30 pmol PGE2劑量依賴(lài)性導(dǎo)致RSNA增強(qiáng)和MAP升高;其中3 pmol PGE2對(duì)心血管功能的影響最為顯著，后續(xù)實(shí)驗(yàn)PGE2劑量選擇3 pmol。
　　3、高血壓狀態(tài)下，RVLM內(nèi)PGE2含量升高由COX-2途徑介導(dǎo)
　　COX-2蛋白表達(dá)在SHR組顯著高于WKY組（標(biāo)準(zhǔn)化為1.0）（1.80±0.11vs.1.00±0.16，P＜0.05，n=4）;而COX

15、-1蛋白表達(dá)在SHR組與WKY組（標(biāo)準(zhǔn)化為1.0）無(wú)顯著性差異（1.17±0.38 vs.1.00±0.19，P＞0.05，n=4）。COX-2蛋白表達(dá)在AngⅡ組顯著高于aCSF組（標(biāo)準(zhǔn)化為1.0）（2.86±0.46 vs.1.00±0.16，P＜0.05，n=5）;而COX-1蛋白表達(dá)在AngⅡ組與aCSF組（標(biāo)準(zhǔn)化為1.0）無(wú)顯著性差異（1.16±0.31vs.1.00±0.32，P＞0.05，n=5）。結(jié)果表明:高血壓狀態(tài)下，

16、RVLM內(nèi)PGE2含量升高來(lái)源于COX-2蛋白高表達(dá)。
　　二、RVLM內(nèi)微量注射PGE2引起氧化應(yīng)激增強(qiáng)
　　1、DHE檢測(cè)RVLM內(nèi)超氧陰離子的變化
　　PGE2組的超氧陰離子含量顯著高于aCSF組（標(biāo)準(zhǔn)化為1.0）（1.50±0.05 vs.1.00±0.08，P＜0.05，n=5），結(jié)果表明，PGE2引起氧化應(yīng)激增強(qiáng)。
　　2、Western Blot檢測(cè)SOD蛋白的表達(dá)量
　　PGE2組的SOD1

17、蛋白表達(dá)量顯著低于aCSF組（標(biāo)準(zhǔn)化為1.0）（0.16±0.03 vs.1.00±0.19，P＜0.05，n=5），同時(shí)PGE2組的SOD2蛋白表達(dá)量也顯著低于aCSF組（標(biāo)準(zhǔn)化為1.0）（0.68±0.05 vs.1.00±0.11，P＜0.05，n=5）。結(jié)果表明:PGE2引起氧化應(yīng)激與抑制ROS消除機(jī)制有關(guān)。
　　3、Western Blot檢測(cè)NOX蛋白的表達(dá)量
　　PGE2組的NOX2蛋白表達(dá)量顯著高于aCSF組

18、（標(biāo)準(zhǔn)化為1.0）（1.00±0.17 vs.2.75±0.62，P＜0.05，n=5），同時(shí)PGE2組的NOX4蛋白表達(dá)量也顯著高于aCSF組（標(biāo)準(zhǔn)化為1.0）（.3.65±0.35 vs.1.00±0.24，P＜0.05，n=5）。結(jié)果表明:PGE2促進(jìn)ROS的生成引起氧化應(yīng)激的增強(qiáng)。
　　三、RVLM內(nèi)微量注射Tempol抑制PGE2的升壓作用
　　Tempol+PGE2組RSNA變化值顯著低于aCSF+PGE2組(7

19、.20±2.76 vs.21.00±3.27％，p＜0.05，n=5);Tempol+PGE2組MAP變化值也顯著低于aCSF+PGE2組(6.40±1.47 vs.27.4±3.12，p＜0.05，n=5)。結(jié)果表明:Tempol能有效抑制PGE2引起的RSNA增強(qiáng)及MAP升高。
　　結(jié)論：
　　本研究顯示COX-2來(lái)源的PGE2在RVLM內(nèi)參與中樞心血管功能的調(diào)節(jié)，并通過(guò)介導(dǎo)NOX2/4蛋白上調(diào)增加和SOD1/2蛋白下調(diào)