煙粉虱不同生物型傳播番茄黃化曲葉病毒機(jī)制研究.pdf

1、煙粉虱（Bemisia tabaci）屬半翅目，粉虱科，是一種重大外來入侵害蟲，危害包括蔬菜、花卉、棉花等在內(nèi)的600多種寄主植物。煙粉虱是一種至少由32個(gè)生物型（或被稱為隱種）組成的復(fù)合種，其中B型和Q型煙粉虱入侵性強(qiáng)，危害也更嚴(yán)重。20世紀(jì)90年代B型煙粉虱進(jìn)入我國(guó)并給我國(guó)園藝作物帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，2005年在我國(guó)云南首次發(fā)現(xiàn)了Q型煙粉虱，在隨后的幾年內(nèi)，發(fā)現(xiàn)Q型煙粉虱有逐漸取代B型的趨勢(shì)，2009年底我國(guó)已經(jīng)至少有21個(gè)省市發(fā)現(xiàn)了

2、Q型煙粉取代了B型。與此同時(shí)，伴隨著Q型煙粉虱種群的快速擴(kuò)散，由煙粉虱傳播的番茄黃化曲葉病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus，簡(jiǎn)稱TYLCV)導(dǎo)致的番茄黃化曲葉病毒病在我國(guó)從南到北多地發(fā)生并流行蔓延，給我國(guó)的番茄生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，局部地區(qū)甚至整棚絕收。然而關(guān)于煙粉虱傳播番茄黃化曲葉病的傳毒機(jī)理以及伴隨B、Q型煙粉虱之間的競(jìng)爭(zhēng)取代而發(fā)生的番茄黃化曲葉病毒病的大發(fā)生機(jī)制研究尚不清楚。因此，本研究以目前煙粉

3、虱的主要危害生物型B型和Q型為研究對(duì)象，篩選出了鑒別B、Q型以及外形相似的溫室白粉虱的分子標(biāo)記，比較了B型和Q型煙粉虱在不同時(shí)間內(nèi)對(duì)TYLCV的獲毒能力以及煙粉虱傳播TYLCV相關(guān)基因GroEL的表達(dá)，同時(shí)運(yùn)用RNA干擾技術(shù)對(duì)GroEL基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明煙粉虱對(duì)TYLCV的傳播機(jī)制補(bǔ)充了資料，也為煙粉虱傳播番茄黃化曲葉病毒病的預(yù)防和控制提供理論指導(dǎo)和科學(xué)依據(jù)。主要結(jié)果如下:
　　 1三種粉虱類害蟲的RAPD標(biāo)

4、記研究:
　　 通過RAPD檢測(cè)，從120條隨機(jī)引物中篩選出2條種間特異性很強(qiáng)的隨機(jī)引物，分別為OPA-17(5’-GACCGCTTGT-3’)和OPE-03(5’-CCA GATGCAC-3’)，它們作為最適宜的區(qū)分B型、Q型和溫室白粉虱三種粉虱害蟲的RAPD引物，通過優(yōu)化PCR條件，建立了OPA-17對(duì)三種不同粉虱害蟲的清晰、不同個(gè)體間穩(wěn)定性強(qiáng)且差異明顯的擴(kuò)增譜，且在多個(gè)地方采集的煙粉虱樣本中得到了預(yù)期的結(jié)果。
　　

5、 2三種粉虱類害蟲的SCAR標(biāo)記:
　　 利用上述RAPD分子標(biāo)記得到的特異性的擴(kuò)增片段，分別轉(zhuǎn)化為溫室白粉虱、煙粉虱B型、煙粉虱Q型的SCAR標(biāo)記，成功地建立了適于供試三種粉虱PCR擴(kuò)增鑒定的特異性引物對(duì)，擴(kuò)增片段分別為412bp，387bp，507bp。這3對(duì)引物僅能在特定粉虱體內(nèi)擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶，且擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性很強(qiáng)。經(jīng)過對(duì)田間粉虱害蟲種群的擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，所建立的溫室白粉虱、煙粉虱B型和Q型的分子標(biāo)記適用性很強(qiáng)。

6、　　 3采用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)B、Q型煙粉虱傳播TYLCV的相關(guān)基因GroEL的表達(dá)進(jìn)行研究。結(jié)果表明:在檢測(cè)的五個(gè)時(shí)間段內(nèi)(6h-72h)，Q型煙粉虱的病毒捕獲量均顯著高于B型;病毒獲取量達(dá)到飽和的時(shí)間也明顯早于B型煙粉虱。表明Q型煙粉虱無論在獲毒能力還是在獲毒時(shí)間上均顯著強(qiáng)于B型煙粉虱。熒光定量PCR技術(shù)比較了煙粉虱傳毒相關(guān)蛋白基因GroEL在兩種生物型煙粉虱體內(nèi)表達(dá)量的差異，結(jié)果表明在兩種生物型內(nèi)，帶毒個(gè)體GroEL基因的表達(dá)

7、量顯著高于未獲毒的煙粉虱個(gè)體，且該基因在Q型煙粉虱是否獲毒的狀態(tài)下的表達(dá)量是B型獲毒狀態(tài)下為1.55倍，非獲毒狀態(tài)下為1.68倍，且差異顯著(P＜0.05)。說明感染TYLCV后，煙粉虱體內(nèi)GroEL的表達(dá)量升高，可能顯示二者存在著密切關(guān)系。
　　 4利用RNA干擾技術(shù)對(duì)研究了煙粉虱傳毒相關(guān)基因GroEL的表達(dá)根據(jù)B型煙粉虱內(nèi)共生菌Hamiltonella所編碼的GroEL基因序列，設(shè)計(jì)了特異性引物擴(kuò)增了B型煙粉虱的GroEL片

8、段，合成相對(duì)應(yīng)的dsRNA，并通過注射的方法將dsRNA導(dǎo)入到煙粉虱偽蛹體內(nèi)，隨后采用RealtimeRT-PCR技術(shù)測(cè)定了不同干擾時(shí)間后，B型煙粉虱體內(nèi)目的基因mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明:不同劑量的dsRNA在注射不同時(shí)間后的干擾效果有所差異，隨著注射后時(shí)間的增加，GroEL基因的mRNA水平都呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，且注射dsRNA濃度在3-4ng/μl時(shí)，注射GroEL基因的dsRNA后48h后mRNA水平顯著下降60-70％，隨后該基

9、因表達(dá)量逐漸恢復(fù)，96小時(shí)后基本恢復(fù)到原來水平。GroEL基因干擾后，煙粉虱對(duì)TYLCV的獲取能力和傳播能力的變化尚待深入求證。
　　 5煙粉虱感染TYLCV后生理學(xué)特性變化B型煙粉虱和Q型煙粉虱種群獲毒72小時(shí)及持續(xù)飼養(yǎng)在帶毒番茄寄主上，測(cè)定感染TYLCV對(duì)B型和Q型煙粉虱的解毒酶系及保護(hù)酶系活性的影響。結(jié)果表明:
　　 (1)解毒酶系的活性: B型和Q型煙粉虱羧酸酯酶(CarE)活性和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的

10、高低順序均為獲毒72小時(shí)＞健康番茄種群＞長(zhǎng)期帶毒飼養(yǎng)種群，而多功能氧化酶(P450)活性為長(zhǎng)期帶毒飼養(yǎng)種群＞獲毒72小時(shí)＞健康番茄種群。
　　 (2)保護(hù)酶系的活性:B型和Q型煙粉虱過氧化氫酶(CAT)的活性，過氧化物酶(POD)的活性和超氧化物歧化酶(SOD)的活性的高低順序均為長(zhǎng)期帶毒飼養(yǎng)種群＞獲毒72小時(shí)＞健康番茄種群。
　　 研究結(jié)果暗示了煙粉虱多功能氧化酶和保護(hù)酶可能由于受到TYLCV病毒的感染誘導(dǎo)而活性升高，