KLF4調控EPCs分化及修復損傷血管的作用研究-.pdf

1、1．背景與目的：
　　 內皮功能紊亂是血管性疾病的重要的病理生理基礎[1,2]，再血管化內皮和再內皮化是介入治療和藥物支架后阻止再狹窄和血栓形成的重要環(huán)節(jié)[3,4]。大量的證據(jù)表明，骨髓源內皮前體細胞(endotheliAlprecusor cells, EPCs)在血管內皮修復和內皮功能替代上起了重要的作用[4,5]。更進一步研究表明，EPCs的增殖與分化是影響內皮修復的重要環(huán)節(jié)[6-8]， EPCs在體內能夠分化成有功能的內

2、皮細胞，參與缺血組織的血管新生并整合到損傷血管壁的新生內膜中參與損傷血管的再內皮化[9-12]。但是，EPCs的歸巢、增殖、分化，其受多種因素影響[13]，其內在調控因素尚不完全清楚。
　　 轉錄因子KLF4通過對其下游基因的調控,在細胞增殖、分化、血管生成和腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種生理、病理過程中起著重要作用。近幾年，研究表明KLF4 調控多種細胞的增殖分化，可能是調節(jié)血管功能和疾病的重要“分子開關”。KLF4 最早發(fā)現(xiàn)于內臟和上皮

3、[14-16]，具有促進細胞終端分化、成長、循環(huán)的功能。其為血流及炎癥因子激活，KLF4 高表達能夠上調eNOS、TM，具有抗炎、抗血栓作用[17-19]。
　　 在本研究我們主要通過構建攜帶KLF4基因的腺病毒載體，過表達KLF4 或小RNA干擾轉染實驗，闡明KLF4在EPCs分化及修復損傷血管中的作用及其機制，期望為深入認識KLF4的生物學功能及EPCs的調控機制提供新的實驗依據(jù)，為進一步促進血管損傷后內皮再生、血管良性修復

4、提供新的策略和靶點。
　　 2．方法：
　　 2.1KLF4在EPCs分化中的表達通過密度梯度離心及選擇性培養(yǎng)的方法在體外分離、培養(yǎng)大鼠骨髓源EPCs，經過細胞形態(tài)學、表面分子標志以及Dil-acLDL/FITC-UEA-I 雙陽性鑒定后，通過RT-PCR以及Western blot分別觀察KLF4在EPCs分化過程中mRNA和蛋白表達水平的表達。
　　 2.2 重組腺病毒Ad-KLF4的構建從大鼠組織提取RNA

5、，經RT-PCR 擴增得到目的基因KLF4 片段，首先構建重組穿梭質粒pTOPO-KLF4。將pTOPO-KLF4與腺病毒載pAd在重組酶的作用下，pTOPO-KLF4的attL1-attL2 序列與腺病毒載體的attR1-attR2 序列發(fā)生同源重組。重組子命名為pAd-KLF4。pAd-KLF4和空載體pAd 經PacI 酶切線性化，暴露出載體的反向終末重復序列，將重組子轉染293細胞進行包裝，擴增后進行滴度的測定。
　　

6、2.3 KLF4在EPCs分化中的作用在EPCs通過Ad-KLF4 過表達或siRNA 沉默KLF4 觀察EPCs分化的表型改變，通過免疫熒光、流式細胞學、RT-PCR 以及Western blot分別觀察成熟血管內皮表型CD31、VWF在EPCs分化過程中免疫熒光、mRNA和蛋白水平的表達。
　　 2.4 KLF4在EPCs分化中的分子機制在EPCs通過Ad-KLF4 過表達或siRNA 沉默KLF4對下游靶基因eNOS的在轉

7、錄、蛋白表達水平的影響，進一步觀察了eNOS 抑制劑L-NAME，對Ad-KLF4 誘導的EPCs分化的影響，以明確eNOS是否參與Ad-KLF4 介導調控的EPCs分化。
　　 2.5 Ad-KLF4 轉染的EPCs與平滑肌細胞共培養(yǎng)對平滑肌的增殖及遷移的影響培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞和內皮細胞，將Ad-KLF4 轉染的EPCs 接種于下室，分別將平滑肌細胞接種于上室，建立細胞共培養(yǎng)體系，通過3H-TdR 參入法檢測平滑肌細胞的增

8、殖作用，用遷移計數(shù)方法檢測平滑肌細胞。
　　 2.6 轉染KLF4基因的EPCs 移植在血管內膜修復中的作用建立大鼠頸動脈球囊損傷模型，將Ad-KLF4 轉染的EPCs通過尾靜脈移植至大鼠體內。2周后在局部血管，通過熒光定量RT-PCR 以及Western blot分別觀察KLF4在血管損傷修復過程中mRNA和蛋白表達，行HE 染色、伊文氏藍染色計算內膜/中膜面積比及損傷血管再內皮化情況。
　　 3．結論：
　　

9、 4.1在EPCs分化過程中KLF4在分化晚期表達，逐漸增高。
　　 4.2 過表達KLF4 促進EPCs 向成熟內皮分化。
　　 4.3 過表達KLF4 促進EPCs的eNOS表達，培養(yǎng)液的NO 增多，eNOS 抑制劑，L-NAME 減低了KLF4在EPCs分化為成熟內皮表型CD31、VWF的蛋白表達，抑制了血管新生。
　　 4.4 KLF4基因修飾EPCs與平滑肌共培養(yǎng)明顯抑制平滑肌的增殖和遷移，同時使平滑肌