羔羊胃提取物維B12膠囊對(duì)大鼠慢性萎縮性胃炎的治療作用及潛在機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　我國(guó)的胃癌早期診斷率一直偏低，導(dǎo)致胃癌的治療效果一直不令人滿意，針對(duì)胃癌癌前病變進(jìn)行干預(yù)代表著對(duì)胃癌積極防御的有效策略。慢性萎縮性胃炎作為胃癌癌前病變的一種，在胃癌的發(fā)展中處于重要的中間環(huán)節(jié)，該階段如能有效治療和干預(yù)，實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，使病變恢復(fù)正常，則可能降低胃癌的發(fā)生率。目前對(duì)于慢性萎縮性胃炎尚無(wú)明確的逆轉(zhuǎn)方法，這有賴于對(duì)其具體發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步深入探究。前期課題組通過(guò)全國(guó)多中心隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照的IV期臨床試驗(yàn)證明羔羊胃提

2、取物維B12膠囊對(duì)于慢性萎縮性胃炎尤其是伴腸化生的病例具有明顯的逆轉(zhuǎn)效果，為了進(jìn)一步完善相關(guān)證據(jù)，并探索可能涉及的機(jī)制，我們以大鼠為模型進(jìn)行了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。
　　目的：
　　探索羔羊胃提取物維B12膠囊對(duì)于大鼠慢性萎縮性胃炎及腸化生的逆轉(zhuǎn)效果，并探索其可能涉及的機(jī)制。
　　方法：
　　1、綜合文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)“MNNG+化學(xué)刺激+低酸+不規(guī)律飲食”多種因素的刺激，誘導(dǎo)建立大鼠慢性萎縮性胃炎模型。具體方法為：6周齡的

3、Wistar大鼠隨機(jī)分為2組，其中造模組大鼠32只，正常對(duì)照組10只，給予造模組Wistar大鼠100μg/ml的MNNG溶液自由飲用,0.03％的雷尼替丁飼料作為食物，每周空腹灌胃1次50%酒精及饑飽失常1次的刺激，共計(jì)20周，以建立大鼠慢性萎縮性胃炎的模型，正常組大鼠給予等量生理鹽水灌胃及正常飲食。期間每周1次記錄好大鼠進(jìn)食飲水量及體重變化等數(shù)據(jù)。造模結(jié)束后正常飲食1.5個(gè)月，于最后一天饑餓24小時(shí)后造模組大鼠處死10只，正常對(duì)照組

4、處死5只，收集各組大鼠胃液、血清及胃組織標(biāo)本，通過(guò)檢測(cè)各組大鼠胃液pH水平及HE染色、免疫組化染色和AB-PAS染色的方法觀察大鼠胃粘膜病理改變，判斷造模是否成功及病變嚴(yán)重程度，為下一步觀察藥物療效實(shí)驗(yàn)打好模型基礎(chǔ)。
　　2、給予羔羊胃提取物維B12膠囊治療階段，將原造模組大鼠（共16只）隨機(jī)分為兩組，分別為給藥組和非給藥組，每組8只，另外設(shè)造模結(jié)束后正常組剩余的5只大鼠為陰性對(duì)照組，共計(jì)三組。給藥組按照0.02g/100g的體重

5、比例灌胃給予羔羊胃提取物維 B12膠囊藥物溶液，正常對(duì)照組及非給藥組均灌胃等量的生理鹽水，各組刺激均持續(xù)3個(gè)月完成給藥治療實(shí)驗(yàn)，于最后一天饑餓24小時(shí)之后處死各組大鼠收集胃液、血清及胃組織標(biāo)本，期間每周記錄各組大鼠進(jìn)食飲水量及體重變化等數(shù)據(jù)。通過(guò)對(duì)比各組大鼠胃液pH水平變化及HE染色、免疫組化染色和AB-PAS染色的方法觀察各組大鼠胃粘膜病理改變情況，判斷羔羊胃提取物維 B12膠囊對(duì)大鼠慢性萎縮性胃炎的治療效果。
　　3、通過(guò)相應(yīng)

6、試劑盒檢測(cè)相關(guān)血清氧化應(yīng)激因子（SOD、GSH-Px、MDA）水平變化及Ki-67和Bax免疫組化染色，判斷羔羊胃提取物維B12膠囊逆轉(zhuǎn)大鼠慢性萎縮性胃炎過(guò)程中可能涉及的機(jī)制通路，為下一步具體的機(jī)制探索指明方向。
　　結(jié)果：
　　1、大鼠慢性萎縮性胃炎的成功建立：造模期間，造模組大鼠進(jìn)食量、飲水量及體重增加值均小于正常對(duì)照組，其中體重變化自第4周開(kāi)始出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（造模組240.16±21.62g vs.正常組291.00±

7、35.52g, P＜0.05）。造模結(jié)束時(shí)，發(fā)現(xiàn)造模組大鼠胃液pH值高于正常對(duì)照組大鼠（造模組3.56±0.62 vs.正常組2.01±0.56,P＜0.05）。HE染色顯示，正常對(duì)照組大鼠胃竇粘膜固有層腺體豐富，腺體形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、腺體萎縮或結(jié)構(gòu)異常等病變；造模組大鼠胃竇大小彎側(cè)粘膜固有層腺體數(shù)目則顯著減少，腺體結(jié)構(gòu)紊亂，排列失去規(guī)則，大小不一，腺體間隙變寬，出現(xiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)兩組大鼠病變進(jìn)行定量評(píng)分統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)

8、現(xiàn)炎癥（造模組2.30±0.64 vs.正常組0.00±0.00,P＜0.05）、萎縮（造模組2.20±0.63 vs.正常組0.00±0.00,P＜0.05）及腸化生病變（造模組0.70±0.82 vs.正常組0.00±0.00,P＜0.05）的評(píng)分均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另外，造模組大鼠粘膜層顯著變薄，黏膜肌層厚度增加，粘膜層與黏膜肌層厚度比值顯著減?。?.34±1.05 vs.2.41±0.77,P＜0.05）。AB-PAS染色結(jié)果顯示造

9、模組大鼠腺體密度明顯降低（造模組7.53±2.31 vs.正常組13.43±1.26， P＜0.05）。兩組大鼠出現(xiàn)慢性萎縮性胃炎的病例統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，造模組大鼠萎縮率達(dá)到100%，腸化率達(dá)到50%，對(duì)照組大鼠未出現(xiàn)萎縮和腸化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、羔羊胃提取物維B12膠囊能夠成功逆轉(zhuǎn)大鼠慢性萎縮性胃炎：給藥后觀察發(fā)現(xiàn)，給藥組大鼠體重增量逐漸大于非給藥組，約在給藥第六周后兩組大鼠體重差異開(kāi)始出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（給藥組508.26±33.96

10、vs.非給藥組495.50±23.01，P＜0.05）。給藥組大鼠胃液 pH值略高于正常對(duì)照組大鼠，但低于非給藥組大鼠，給藥組與非給藥組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（給藥組3.07±0.55 vs.非給藥組4.45±0.72，P＜0.05）。對(duì)給藥組和非給藥組大鼠病變進(jìn)行定量評(píng)分統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)炎癥評(píng)分（給藥組1.43±0.53 vs.非給藥組2.14±0.69,P=0.051）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而萎縮（給藥組1.57±0.79 vs.非給藥組2.7

11、1±0.49,P=0.007）和腸化生病變（給藥組0.71±1.50 vs.非給藥組3.57±0.79,P=0.001）的評(píng)分均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。給藥組大鼠胃黏膜層與黏膜肌層厚度與正常對(duì)照組大鼠較接近，非給藥組大鼠胃粘膜層厚度仍明顯減低，黏膜肌層厚度明顯增加，二者比值與給藥組相比也減小，兩組比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（給藥組3.78±0.45 vs.非給藥組2.37±0.38， P＜0.05）。非給藥組大鼠胃粘膜單位長(zhǎng)度(1mm)內(nèi)腺體數(shù)目均值為

12、7.47±2.06，明顯小于給藥組大鼠的9.58±1.51（P＜0.05）。統(tǒng)計(jì)胃粘膜表面增生結(jié)節(jié)數(shù)目發(fā)現(xiàn)，胃底、胃竇及全胃范圍內(nèi)給藥組與非給藥組數(shù)目均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見(jiàn)正文第二部分圖2-3）。各組大鼠胃粘膜病變總體統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，給藥組大鼠重度萎縮率和腸化率明顯小于非給藥組大鼠（重度萎縮率：給藥組14.29%vs.非給藥組71.43%， P＜0.05；腸化率：給藥組28.58%vs.非給藥組57.14%，P＜0.05）。
　　3、羔

13、羊胃提取物維B12膠囊逆轉(zhuǎn)慢性萎縮性胃炎病變涉及的潛在機(jī)制：Ki-67組化染色顯示，給藥組病變處增殖活力增高，活力與正常組相當(dāng)，未給藥組的相同組織部位增殖活力低于給藥組，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)給藥組與非給藥組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Bax組化染色顯示，給藥組病變處細(xì)胞凋亡減輕，未給藥組的相同組織部位凋亡染色結(jié)果強(qiáng)于給藥組，提示羔羊胃藥物可能抑制胃組織細(xì)胞的凋亡，從而避免萎縮加重。比較各組大鼠血清氧化應(yīng)激因子水平發(fā)現(xiàn)，給藥后，給藥組大鼠的血清SOD水平和GSH-

14、Px水平明顯升高，MDA水平則顯著下降，與正常組大鼠血清相應(yīng)因子水平差距減小，與非給藥組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)正文第二部分表2-7、表2-8和表2-9）。
　　結(jié)論：
　　1、利用Wistar大鼠給予其100μg/ml的MNNG溶液自由飲用,0.03%的雷尼替丁飼料作為食物，每周空腹灌胃1次50%酒精及饑飽失常的刺激方法，歷時(shí)20周，可以成功建立大鼠慢性萎縮性胃炎的病變模型，并且成功率高，模型穩(wěn)定性好。