CpG-ODN對HepG2細胞及其相關因子的作用研究.pdf

1、目的：
　　 研究未甲基化CpG寡核苷酸（CpG-ODN）對肝癌細胞HepG2的作用：一方面包括CpG-ODN通過具有TLR9陽性表達（TLR9+）的人外周血單核細胞（PBMC）對HepG2的間接作用，另一方面包括CpG-ODN對TLR9+HepG2細胞的直接作用，以此對CpG-ODN在腫瘤免疫治療中的安全性作出初步評價。
　　 方法：
　　 主要包括三方面：1）提取含有CpG-ODN的質粒，用質粒CpG-ODN

2、、多肽單獨或聯(lián)合刺激PBMC，之后與HepG2共孵育，分別提取兩種細胞的總RNA，并進行反轉錄得到cDNA，設計合成MyD88、Caspase-8的PCR引物，以得到的cDNA為模版，β-actin為內參進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測MyD88、Caspase-8的表達情況；2）使用磷硫酰CpG-ODN刺激TLR9+細胞，即PBMC和HepG2，提取總RNA進行反轉錄得到cDNA，設計合成抗凋亡因子Bcl-xL、Bcl-2，凋亡因子

3、Bid以及TLR9的PCR引物，以β-actin為內參進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測Bcl-xL、Bid、Bcl-2、TLR9的表達情況；3）使用磷硫酰CpG-ODN刺激HepG2，流式細胞儀檢測細胞周期。
　　 結果：
　　 1、質粒CpG-ODN能誘導與HepG2共孵育后的PBMC高表達MyD88，間接影響HepG2中MyD88、Caspase-8的表達；
　　 2、CpG-ODN對PBMC中Bcl-

4、xL、Bid表達有一定影響，對HepG2中Bcl-xL、Bcl-2、Bid表達的影響較明顯，即當CpG-ODN的濃度在0～3μM范圍內升高時，HepG2中抗凋亡基因Bcl-xL、Bcl-2的mRNA水平有降低趨勢，凋亡因子Bid有增高趨勢，抗凋亡因子與凋亡因子的比率減小；
　　 3、正常狀態(tài)HepG2在0.5～2.5μM CpG-ODN作用下，細胞周期無明顯變化；在2.5～25μM CpG-ODN作用下，HepG2細胞周期中的

5、G1期增大，S+G2/M期減??；在25～50μM CpG-ODN作用下，G1期減小，S+G2/M期增大；
　　 4、生長狀態(tài)不良的HepG2在CpG-ODN作用下，凋亡率APO明顯增大，且呈劑量-效應依賴性。
　　 結論：
　　 TLR信號通路中的關鍵接頭分子——MyD88，該信號通路的激活可能是質粒CpG-ODN刺激PBMC殺傷腫瘤細胞的作用機制之一，此外PBMC殺傷HepG2的分子機制中可能涉及HepG2中

6、Caspase-8的表達；CpG-ODN可能是通過調控Bcl-2家族成員表達而有誘導HepG2凋亡的趨勢，這包括Bcl-xL、Bcl-2、Bid；在HepG2狀態(tài)正常條件下，低濃度CpG-ODN（0.5～2.5μM）對HepG2細胞周期的作用不明顯，中濃度CpG-ODN（2.5～25μM）對HepG2的增殖有一定的抑制作用，高濃度CpG-ODN（25～50μM）有促進HepG2增殖的趨勢；在HepG2狀態(tài)不良條件下，CpG-ODN可以促