脂肪干細胞對周圍神經再生作用潛能的研究.pdf

1、目的:臨床上周圍神經損傷的患病率較高，并可由多種病因導致，為有效地恢復神經的連續(xù)性及其功能，臨床醫(yī)生及研究人員做了大量的研究工作。修復短距離的神經損傷較為容易，可直接拉攏兩側神經的殘端進行縫合，恢復其神經連續(xù)性。但是，長距離的神經缺損由于神經斷端張力的問題無法采用直接縫合的方法，進行神經或移植物移植就成為了唯一切實有效的辦法。自體神經移植是臨床治療長距離周圍神經缺損的金標準，但由于供體資源有限、供區(qū)可能出現的感覺及功能減退、增加手術瘢痕

2、及創(chuàng)傷和受區(qū)神經可能形成神經瘤等缺點，局限了自體神經移植的適應癥。
　　近年來隨著再生醫(yī)學的興起，研究人員對于長距離周圍神經缺損的修復拓寬了思路，進行了新的嘗試，旨在構建再生的周圍神經。同構建其他再生組織一樣，有效地選擇、培養(yǎng)并移植種子細胞以及移植后細胞功能的有效發(fā)揮是再生周圍神經成功修復周圍神經缺損的關鍵環(huán)節(jié)。種子細胞促進神經再生的作用主要體現在其能夠分泌促進周圍神經再生的生長因子及細胞外基質，并通過其作用于再生的軸突。

3、　　脂肪干細胞是一種具有多向分化潛能的成體干細胞，較易分離，在體外培養(yǎng)增殖較為迅速，且在一定條件下能夠誘導分化為類雪旺細胞，提示其可作為構建再生周圍神經的種子細胞。但脂肪干細胞植入宿主體內后，其修復周圍神經損傷的機制尚不明確，向類雪旺細胞分化可能僅是其功能體現的一個方面。我們推測脂肪干細胞植入體內后可能作為兩種狀態(tài)存在，未分化狀態(tài)和向類雪旺細胞分化狀態(tài)，類雪旺細胞分化可能是由于雪旺細胞釋放某些細胞因子促使脂肪干細胞向其分化，并可能發(fā)揮類

4、似雪旺細胞的功能，而未分化的脂肪干細胞則可能分泌細胞因子和細胞外基質調節(jié)雪旺細胞功能發(fā)揮促進周圍神經再生的作用。
　　神經支架必須滿足多種要求，包括構建一個可滲透的，具備生物相容性的環(huán)境，從而允許細胞浸潤和恢復損傷導致的神經元連接。透明質酸廣泛分布于動物體內，是細胞外基質的重要組成部分，具有高度的親水性和粘彈性，很少與細胞粘連且可預防瘢痕的生成。在一系列包含細胞外纖維基質的沉積及重塑的生物學進程中，透明質酸作為細胞-基質相互作用在

5、細胞增殖及遷移過程中起到至關重要的作用。
　　本研究通過脂肪干細胞的體外分離培養(yǎng)，檢測其促進神經再生的分泌功能;通過體外間接共培養(yǎng)的方式，探討脂肪干細胞與雪旺細胞的相互作用關系及脂肪干細胞促進神經再生的相關機制;通過透明質酸鈉水凝膠與脂肪干細胞體外相容性的研究，擬為周圍神經再生尋找一種理想的支架材料。
　　研究方法:1、大鼠脂肪干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定細胞表面標記
　　2、大鼠脂肪干細胞體外向脂肪細胞及成骨細胞的分化誘

6、導
　　3、免疫熒光法及ELISA法檢測大鼠脂肪干細胞表達及分泌神經生長因子(NGF)、膠源性神經營養(yǎng)因子(GDNF)、纖維粘連蛋白(Fibronectin)及層粘連蛋白(Laminin)的功能
　　4、大鼠雪旺細胞的體外分離、培養(yǎng)及免疫熒光法鑒定S-100表達
　　5、大鼠脂肪干細胞體外向雪旺細胞的分化誘導
　　6、建立大鼠脂肪干細胞與雪旺細胞共培養(yǎng)體系
　　分別取第三代大鼠脂肪干細胞與雪旺細胞通過Tra

7、nswell共培養(yǎng)皿（濾網孔隙直徑0.4μm）進行細胞共培養(yǎng)。
　　7、免疫熒光及Western Blot法檢測誘導后和共培養(yǎng)后的脂肪干細胞S-100和GFAP的表達
　　8、RT-PCR檢測及共培養(yǎng)體系中雪旺細胞及對照組雪旺細胞NGF、GDNF、Fibronectin、Laminin的表達
　　9、ELISA檢測共培養(yǎng)體系中培養(yǎng)基上清液及脂肪干細胞和雪旺細胞對照組培養(yǎng)基上清液中NGF、GDNF、Fibronectin

8、、Laminin的含量
　　10、制備透明質酸鈉水凝膠
　　11、CCK-8法檢測透明質酸鈉水凝膠對脂肪干細胞的毒性作用及增殖作用
　　12、AnnexinⅤ-FITC和PI雙重染色檢測透明質酸鈉水凝膠對脂肪干細胞的凋亡作用
　　13、與透明質酸共培養(yǎng)的大鼠脂肪干細胞向雪旺細胞的分化誘導
　　14、電鏡檢測透明質酸鈉水凝膠表面及其內部的細胞形態(tài)及結構
　　15、免疫熒光檢測與透明質酸鈉水凝膠共培養(yǎng)誘導

9、后的脂肪干細胞S-100和GFAP的表達
　　16、統(tǒng)計學處理
　　所有數據采用SPSS13.0軟件分析，p＜0.05為差異有顯著性。
　　結果:1、體外提取大鼠脂肪干細胞并進行傳代，第3代脂肪干細胞流式細胞儀檢測表面標記結果顯示:CD29和CD44陽性，CD45和CD11陰性。脂肪干細胞生長曲線顯示細胞生長無明顯遲滯期，第6d達到生長峰值。
　　2、大鼠脂肪干細胞體外成脂誘導分化14d油紅染色脂滴處呈紅色，成骨

10、誘導分化21d茜素紅染色可見細胞形成典型的橘紅色鈣化結節(jié)。
　　3、免疫熒光及ELISA法檢測結果表明大鼠脂肪干細胞表達并分泌神經營養(yǎng)因子NGF、GDNF及細胞外基質Fibronectin、Laminin。
　　4、體外提取大鼠雪旺細胞并進行傳代，第3代雪旺細胞免疫熒光染色可見S-100在細胞漿內表達。雪旺細胞生長曲線顯示細胞在3d后開始快速增殖。
　　5、第三代脂肪干細胞分化培養(yǎng)基作用2w后，細胞由成纖維細胞樣或梭形

11、逐漸變?yōu)榧忓N形，且兩端可見較長的突起，形態(tài)類似雪旺細胞。
　　6、通過Transwell細胞共培養(yǎng)體系檢測到雪旺細胞培養(yǎng)48h后快速增殖，共培養(yǎng)體系中雪旺細胞增殖曲線與單純雪旺細胞對照組曲線類似，但總體的增殖速度卻要明顯高于對照組。
　　7、免疫熒光檢測結果顯示雪旺細胞、分化后的脂肪干細胞及共培養(yǎng)的脂肪干細胞S-100及GFAP呈陽性，而未分化的脂肪干細胞呈陰性。
　　8、Western Blot方法進一步驗證雪旺細胞

12、、分化后的脂肪干細胞及共培養(yǎng)的脂肪干細胞顯示S-100及GFAP的免疫反應條帶。但在未分化的脂肪干細胞未顯示。
　　9、RT-PCR檢測結果顯示共培養(yǎng)的雪旺細胞較單純雪旺細胞對照組NGF、GDNF、Fibronectin及Laminin表達明顯增高。
　　10、ELISA檢測結果顯示共培養(yǎng)上清液中NGF、GDNF、Fibronectin及Laminin的含量較對照組明顯增高。
　　11、CCK-8進行細胞毒性檢測，共培

13、養(yǎng)3d后，第三代大鼠脂肪干細胞與透明質酸鈉水凝膠共培養(yǎng)實驗組細胞活性明顯高于對照組。
　　12、細胞增殖檢測結果顯示，透明質酸鈉水凝膠可以促進未分化脂肪干細胞的增殖。
　　13、AnnexinⅤ-FITC和PI雙重染色結果顯示，隨著時間的增加，實驗組的細胞凋亡率較對照組的輕與透明質酸鈉水凝膠共培養(yǎng)微升高。
　　14、與透明質酸鈉水凝膠共培養(yǎng)第三代脂肪干細胞應用分化培養(yǎng)基作用2w后，細胞由成纖維細胞樣或梭形逐漸變?yōu)榧忓N形

14、，且兩端可見較長的突起。免疫熒光檢測結果顯示分化后的脂肪干細胞S-100及GFAP呈陽性，而未分化的脂肪干細胞呈陰性。
　　15、掃描電鏡顯示未分化脂肪干細胞及分化的脂肪干細胞在透明質酸鈉水凝膠表面均保持完整的細胞形態(tài)。
　　結論:1、自大鼠脂肪組織中能夠分離脂肪干細胞，并在體外穩(wěn)定傳代。大鼠脂肪干細胞可以表達并分泌神經營養(yǎng)因子及細胞外基質，為周圍神經再生提供營養(yǎng)基礎及穩(wěn)定的微環(huán)境。2、大鼠脂肪干細胞可在體外向雪旺細胞分化，