擴(kuò)展青霉脂肪酶基因在釀酒酵母中的表達(dá)及分子突變.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、該論文報(bào)道了擴(kuò)展青霉堿性脂肪酶(Penicillium expansum lipase,PEL)成熟肽基因lip及帶有自身信號(hào)肽的基因lip07在釀酒酵母中的表達(dá),對(duì)釀酒酵母表達(dá)脂肪酶的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,并運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)PEL基因第227位氨基酸殘基進(jìn)行分子突變.將堿性脂肪酶基因lip、lip07分別連接到釀酒酵母表達(dá)載體,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pVT102U/α-lip、pVT102U/α-L-lip07,并分別電轉(zhuǎn)入釀酒酵母Sacch

2、aromyces cerevisiaw S78,篩選重組菌株S78-pVT102U/α-lip及S78-pVT102U/α-L-lip07.結(jié)果表明lip及l(fā)ip07均獲得了分泌表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中,分子量約為28kDa,與天然擴(kuò)展青霉脂肪酶基本一致.其中,重組酵母S78-pVT102U/α-lip搖瓶發(fā)酵72h,酶活可達(dá)20U/ml;S78-pVT102U/α-L-lip07表達(dá)的脂肪酶很少,表達(dá)產(chǎn)物僅在三丁酸甘油酯平板上形成

3、透明圈.從移種量、培養(yǎng)基pH、碳源及培養(yǎng)基組成等方面對(duì)S78-pVT102U/α-lip進(jìn)行初步的發(fā)酵條件優(yōu)化,結(jié)果表明:適宜的培養(yǎng)基組成為3％酵母抽提物、3%胰化蛋白胨、2%蔗糖;移種量為1.3%;起始pH為7.0,28℃搖瓶發(fā)酵72h,上清液酶活達(dá)56U/ml,為優(yōu)化前的2.8倍.采用重疊延伸PCR方法將脂肪酶第227位絲氨酸突變?yōu)楦彼?將突變后的基因lip-S227P克隆到畢赤酵母表達(dá)載體,將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pPPIC3.5K-l

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