miRNA對骨質疏松癥BMMSCs免疫調節(jié)功能的調控作用.pdf

1、骨質疏松癥(Osteoporosis，OP)以骨結構破壞為主要特征的一類受免疫調控的慢性炎性骨疾病，是造成機體骨量喪失的最主要的原因之一。在口腔治療領域，為種植、修復義齒和頜面外科手術治療帶來很大困難。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)因具有免疫調節(jié)功能和多向分化潛能而受到廣泛關注。目前，關于骨質疏松癥影響MSCs生物學特性的研究較為局限，多集中于MSCs分化能力的異常，對于其免疫調節(jié)功能是否存在改變

2、則研究較少。最近研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs(miRNAs)以其特有的靶向結合目的mRNAs特點可調控MSCs多向分化能力，從而在骨質疏松癥發(fā)生發(fā)展和治療中發(fā)揮了重要作用。然而，在骨質疏松癥病理狀態(tài)下是否存在miRNAs調控MSCs的免疫調節(jié)功能則缺乏相關研究。
　　研究目的：
　　旨在探析骨質疏松癥個體MSCs免疫調節(jié)能力是否存在異常及其作用途徑，并進一步探討該途徑是否存在miRNA的調控，并確定抑制何種miRNA能逆轉其

3、免疫調節(jié)能力的減弱，以加深對骨質疏松癥和MSCs免疫調節(jié)機制的了解，為臨床上治療疾病提供新的思路和方法。
　　研究方法：
　　1.雌性8周齡C57BL/6J小鼠構建OVX與sham模型。4周后Micro-CT檢測模型構建成功。骨髓培養(yǎng)OVXBMMSCs(O/BMMSCs)與shamBMMSCs(S/BMMSCs)。流式細胞儀檢測細胞表面抗原標記。給予O/BMMSCs與S/BMMSCs特定的誘導刺激環(huán)境，鑒定兩組BMMSCs多

4、向分化潛能。
　　2.雌性8周齡體重相近的C57BL/6J小鼠構建炎癥性腸炎模型，尾靜脈注射O/BMMSCs與S/BMMSCs治療分析兩組療效差異。O/BMMSCs與S/BMMSCs與T淋巴細胞共培養(yǎng)，檢測兩組細胞對T淋巴細胞凋亡、趨化遷移能力的影響，Elisa檢測兩組BMMSCs分泌趨化因子MCP-1的表達。
　　3.檢測與O/BMMSCs及S/BMMSCs免疫調控能力相關的Fas及FasL基因表達差異。miRNA數(shù)據(jù)庫分

5、析篩選出可能調控Fas及FasL基因的miRNA。實時定量PCR、Western Blot和構建熒光素酶報告載體等方法，進行該miRNA調控Fas及FasL的靶基因驗證。
　　4.細胞轉染技術抑制O/BMMSCs中Let-7a的表達，采用尾靜脈注射BMMSCs治療炎癥性腸炎小鼠，轉染后BMMSCs與T淋巴細胞共培養(yǎng)，分析抑制Let-7a表達對O/BMMSCs異常免疫調控能力的逆轉作用。
　　研究結果：
　　1.構建完成

6、4周的OVX與sham小鼠動物模型，OVX組小鼠股骨干骺端骨小梁數(shù)量、骨密度、骨體積分數(shù)與sham組相比明顯降低，骨小梁間隙明顯增大。O/BMMSCs與S/BMMSCs均正常表達間充質干細胞表面標志。誘導一定時間后兩組細胞均具有成骨和成脂分化潛能。O/BMMSCs成骨能力弱于S/BMMSCs，而成脂能力強于S/BMMSCs。
　　2.O/BMMSCs較S/BMMSCs治療小鼠炎癥性腸炎效果欠佳。O/BMMSCs共培養(yǎng)組T淋巴細胞凋

7、亡和趨化遷移及分泌趨化因子MCP-1能力均弱于S/BMMSCs組。
　　3.O/BMMSCs與S/BMMSCs相比Fas及FasL在基因水平上表達無統(tǒng)計學差異，而在蛋白水平上O/BMMSCs相關基因表達低于S/BMMSCs。Fas、FasL mRNA的3'非編碼區(qū)存在Let-7a的結合位點。O/BMMSCs的Let-7a表達水平高于S/BMMSCs。檢測證實，F(xiàn)as及FasL是Let-7a的靶基因，受Let-7a的調控。
　

8、　4.在O/BMMSCs中抑制Let-7a的表達能提升O/BMMSCs分泌趨化因子MCP-1的能力，進而促進T淋巴細胞的趨化遷移和凋亡，最終改善炎癥性腸炎的治療效果。
　　研究結論：
　　O/BMMSCs通過Fas/FasL途徑介導T淋巴細胞凋亡以下調免疫調節(jié)能力，影響其對炎癥性腸炎的療效，F(xiàn)as/FasL途徑受miRNA調控，該miRNA為Let-7a，通過Let-7a抑制作用調控T淋巴細胞遷移趨化和凋亡，影響O/BMMS