改良骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)的方法.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)也稱骨髓基質(zhì)來源干細胞,是存在于骨髓中除造血干細胞以外另一類具有多向分化潛能的干細胞。在一定誘導條件下,這類細胞可定向分化為多種造血以外的組織,特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細胞,例如成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、腱細胞、肌肉細胞、神經(jīng)細胞等。另外間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)體外獲取容易,創(chuàng)傷微小,具有無

2、限增殖和多向分化的潛能,再加上BMSCs具有貼壁生長的特性,在體外易分離和擴增,還易于外源基因的轉(zhuǎn)入和表達,所以BMSCs受到醫(yī)學界的青睞,它成為一種理想的細胞治療工具和基因治療的靶細胞。開創(chuàng)了再生醫(yī)學和組織工程的先河。然而間充質(zhì)干細胞在骨髓中的含量很低,需要進行體外分離純化和大量增殖。這是目前面臨的主要問題。
　　 目的：通過觀察不同血清微環(huán)境對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的生長增殖狀態(tài)的影響得到一種更適合BMSCs體外生長的環(huán)境,以

3、利于改良骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)的方法,提高體外培養(yǎng)的獲得率,以便于其體外擴增和純化,更好的應用于臨床治療。
　　 方法：自6-8W齡SD雄性大鼠股骨、脛骨和腓骨中分離提取骨髓間充質(zhì)干細胞。采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)。分別給于以下三種血清微環(huán)境進行培養(yǎng):同種異體血清組:分離提取細胞后原代用含10％大鼠同種異體血清的培養(yǎng)基培養(yǎng),以后換液傳代時用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng);胎牛血清組:分離提取細胞后原代用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng),以

4、后換液傳代時仍用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng);無血清組:分離提取細胞后原代用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),以后換液傳代時用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察不同血清微環(huán)境下骨髓間充質(zhì)干細胞的生長形態(tài)、細胞生長曲線,流式細胞儀檢測不同血清微環(huán)境培養(yǎng)條件下的細胞表面分子CD45和CD90的表達。應用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。
　　 結(jié)果：大鼠同種異體血清微環(huán)境下培養(yǎng)細胞形態(tài)較小,呈紡錘狀,網(wǎng)狀生長。

5、10%胎牛血清微環(huán)境下培養(yǎng)細胞呈梭形成纖維樣,集落式生長。無血清微環(huán)境下培養(yǎng)細胞稀少,只有稍許集落式生長。生長曲線中大鼠同種異體血清組倍增速度最快,其次為10%胎牛血清組,而無血清組未見明顯倍增速率。流式細胞儀檢測含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下各組第三代細胞的CD90陽性表達率均在80%以上,CD45陽性表達率在2%以下。而在無血清培養(yǎng)條件下CD90陽性表達率在74.09%,CD45陽性表達率卻在6.09%。這說明無血清微環(huán)境下培養(yǎng)的細胞純度明

6、顯低于含血清微環(huán)境下培養(yǎng)的細胞。
　　 結(jié)論：在含體積分數(shù)為10%的大鼠同種異體血清微環(huán)境培養(yǎng)條件下所培養(yǎng)的細胞形態(tài)均一性好,融合度均高于其他組,且細胞首次傳代的時間明顯短于其他血清微環(huán)境。且含體積分數(shù)為10%的大鼠同種異體血清和10%胎牛血清均適合骨髓間充質(zhì)干細胞的生長,但在同種異體血清微環(huán)境下細胞增殖更快,而在無血清培養(yǎng)條件下未見明顯增殖現(xiàn)象。根據(jù)以上結(jié)果表明同種異體血清微環(huán)境下更適于骨髓間充質(zhì)干細胞的生長和純化,更有利于體