金黃色葡萄球菌ArtR的功能研究及RANⅢ結(jié)合蛋白的鑒定.pdf

1、金黃色葡萄球菌是典型的革蘭氏陽(yáng)性條件致病菌，在環(huán)境中分布廣泛。近年來(lái)，金黃色葡萄球菌已成為主要的臨床感染菌，醫(yī)院內(nèi)每年都會(huì)有數(shù)以百萬(wàn)的金黃色葡萄球菌感染發(fā)生。金黃色葡萄球菌感染能夠引發(fā)的癥狀有食物中毒、潰瘍、心內(nèi)膜炎、骨髓炎、肺炎等，甚至引起敗血性休克而導(dǎo)致死亡。金黃色葡萄球菌之所以能引起如此多的病癥，是因?yàn)樗芊置诙喾N致病因子，其中α溶血素是非常重要的毒素之一。在感染過(guò)程中，這些毒性因子受到了廣泛而精細(xì)的調(diào)控，從而幫助細(xì)菌響應(yīng)和適應(yīng)各

2、種復(fù)雜的環(huán)境。這些調(diào)控因子包括二元信號(hào)系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和非編碼RNA等。
　　我們?cè)谇捌谘芯縇uxS/AI-2信號(hào)系統(tǒng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與luxS反向重復(fù)的sRNA。Northern blot和RACE分析證實(shí)，這個(gè)sRNA全長(zhǎng)為345nt，并將其命名為ArtR。序列分析和RT-PCR等實(shí)驗(yàn)表明，ArtR是金黃色葡萄球菌中所特有的一種sRNA，它的表達(dá)受到Agr群體感應(yīng)系統(tǒng)的抑制。但是這種抑制效應(yīng)不是通過(guò)Agr群體感應(yīng)系統(tǒng)常用的RN

3、AⅢ來(lái)實(shí)現(xiàn)，而是直接通過(guò)AgrA蛋白與ArtR的啟動(dòng)子相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)?；蚯贸龑?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ArtR的缺失影響了金黃色葡萄球菌α溶血素的水平。而凝膠阻滯分析實(shí)驗(yàn)證明，ArtR并不能直接結(jié)合α溶血素的mRNA。于是我們尋找了α溶血素相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)ArtR突變株中α溶血素的抑制因子SarT的水平有所升高。通過(guò)凝膠阻滯分析和RNA酶解等實(shí)驗(yàn)我們證實(shí)ArtR通過(guò)與sarT5'UTR上的一段區(qū)域與相互作用，促進(jìn)了RNaseⅢ對(duì)sarT mRNA

4、的降解。這項(xiàng)研究鑒定了金黃色葡萄球菌屬中一個(gè)新的毒性相關(guān)的sRNA，并且闡明它是通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子mRNA相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)其調(diào)控過(guò)程的。
　　sRNA調(diào)控不僅局限于sRNA與靶RNA的相互作用，可能有很多蛋白質(zhì)參與其中。但是由于技術(shù)的限制，對(duì)金黃色葡萄球菌中sRNA相關(guān)的蛋白質(zhì)知之甚少。我們通過(guò)前期的研究工作成功建立了利用tRNA融合RNA適配體(簡(jiǎn)稱tRSA)進(jìn)行sRNA蛋白質(zhì)pull-down的實(shí)驗(yàn)體系，選取了金黃色葡萄球菌中重要的

5、sRNA——RNAⅢ，對(duì)其結(jié)合蛋白進(jìn)行釣取。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)tRSA標(biāo)記的RNA能夠較好被鏈霉親和素磁珠捕獲，用這個(gè)體系成功釣取了81個(gè)能夠結(jié)合RNAⅢ的候選蛋白質(zhì)。我們進(jìn)一步通過(guò)蛋白質(zhì)表達(dá)、凝膠阻滯分析驗(yàn)證了這些候選蛋白與RNAⅢ的結(jié)合能力。選取的9個(gè)蛋白質(zhì)中，RNaseⅢ對(duì)RNAⅢ具有降解活性，7個(gè)蛋白（CshA、RNase J2、Era、Hu、WalR、Pyk、FtsZ）可以結(jié)合RNAⅢ，PfkA沒(méi)有檢測(cè)出結(jié)合能力。同時(shí)選取了兩個(gè)pull