淫羊蒮苷對皮質酮誘導的原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元損傷的保護作用及其機制探討.pdf

1、應激性是生物體的普遍特性。應激(Stress)是指機體受到各種應激原刺激時出現(xiàn)的以交感神經(jīng)興奮性增高和下丘腦-垂體-腎上腺軸(Hypothalamic-pituitary-adrenal,HPAaxis)過度激活為主的一系列神經(jīng)內分泌反應。HPA軸持續(xù)反復激活導致其終末靶腺腎上腺皮質分泌過多的GC,是應激反應的最重要特征。海馬對應激反應有整合作用,對GC的分泌起非常重要的調節(jié)作用,是HPA軸應激反應的高位調節(jié)中樞,是慢性應激損傷的敏感區(qū)

2、。生理劑量的GC對機體有益,而過量的GC則對機體有害,特別是對海馬神經(jīng)元產(chǎn)生不良作用。細胞凋亡是GC導致海馬神經(jīng)元損傷的其中最主要機制之一。已有研究表明,淫羊藿具有改善學習記憶功能及抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用。但淫羊藿苷對皮質酮所致海馬神經(jīng)元損傷保護作用的具體機制尚未見報道。
　　 研究目的:探討淫羊藿苷對皮質酮誘導的大鼠原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元損傷保護作用的可能機制。
　　 研究方法:
　　 1.采用新生24h以內Spr

3、ague-Dawley大鼠原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元。
　　 2.采用MTT法和LDH釋放法觀察皮質酮誘導的原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的存活率以及淫羊藿苷干預后的影響。
　　 3.采用Hochest33258、TUNEL原位熒光染色、線粒體跨膜電位以及caspase-3分光光度法檢測淫羊藿苷干預后對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元凋亡的影響。
　　 4.采用熒光分光光度法利用Fura2-AM熒光探針檢測淫羊藿苷干預后海馬神經(jīng)元胞內游離鈣離子濃

4、度的變化。
　　 5.采用DCFH-DA熒光探針檢測淫羊藿苷干預皮質酮誘導的海馬神經(jīng)元活性氧的水平并檢測細胞內總SOD的含量。
　　 6.采用Westernblot蛋白檢測方法探索淫羊藿苷神經(jīng)保護作用的可能作用信號轉導通路MAPK和P13K/Akt。
　　 研究結果:
　　 1.1形態(tài)學結果顯示,1uM和10uM濃度的CORT對海馬神經(jīng)元的作用較明顯,其突觸、包膜和胞核均有不同程度的損傷,表現(xiàn)為突起斷裂,

5、包膜不完整,胞體膨脹,胞核固縮,而10nM、50nM、100nM幾乎對神經(jīng)元無作用。淫羊藿苷能夠逆轉這種損傷作用。
　　 2.2MTT法和LDH法結果顯示,1uM和10uM濃度的CORT作用于原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元24h后,其細胞存活率分別為58.1％和44.7％,作用于48h后分別下降為46.3％和16.8％,至72h后,其細胞存活率均接近15％,且呈濃度和時間依賴性下降,用10-5-10-6mmol/L三個濃度的淫羊藿苷預處理2

6、h,然后和1uM的皮質酮共孵育24h,發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷能明顯減少皮質酮干預后的神經(jīng)元的損傷,與對照組相比有顯著性差異(p＜0.01),但三個劑量之間無明顯差異。SB203580是MAPK通路中p38MAPK特異性阻斷劑,LY294002是P13K/Akt信號轉導通路中P13K的抑制劑,采用這兩個阻斷劑分別特異性阻斷這兩條信號轉導通路,則淫羊藿苷的保護作用被抵消。
　　 3.3HochesG3258,TUNEL原位熒光染色、線粒體跨膜

7、電位以及capase-3檢測結果顯示,大鼠海馬神經(jīng)元暴露于1uM皮質酮24h后出現(xiàn)明顯的核濃縮和胞體膨脹,而正常對照組則表現(xiàn)為圓形的細胞核形態(tài)。給與10-6mmol/L淫羊藿苷干預后,與模型組比較,核固縮的神經(jīng)元比例大幅降低。皮質酮干預海馬神經(jīng)元24h后,經(jīng)TUNEL法檢測可見較多的凋亡陽性細胞,數(shù)個成群分布,表現(xiàn)為細胞核紅色著染、核染色質濃縮與邊移等凋亡細胞的形態(tài)特征。而正常組只有較少的紅染得凋亡陽性細胞。用淫羊藿苷干預后,細胞核紅染

8、的凋亡陽性細胞比例減少,提示淫羊藿苷能夠抑制皮質酮所致的海馬神經(jīng)元凋亡。用Rhodamine123熒光探針檢測神經(jīng)元內線粒體跨膜電位,染色結果顯示,正常對照組幾乎見不到綠色熒光,而皮質酮干預組綠色熒光非常強,淫羊藿干預后,綠色熒光減弱。Caspase-3檢測結果顯示,模型組較空白對照組caspase-3的OD值明顯升高,有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);淫羊藿處理后其OD值和相對活性有極顯著的降低(P＜0.01)。
　　 4.本研究

9、發(fā)現(xiàn)1uM皮質酮作用于海馬神經(jīng)元24h后,其胞內鈣熒光強度較空白對照組明顯升高,統(tǒng)計學上有顯著性差異(P＜0.01),用10-6mmol/L淫羊藿苷干預后能顯著抑制有皮質酮引起的海馬神經(jīng)元胞內游離鈣離子濃度的異常升高,統(tǒng)計學上有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 5.在本研究中我們采用DCFH-DA熒光探針進行活性氧的檢測,同時檢測神經(jīng)元總SOD,結果顯示,皮質酮干預海馬神經(jīng)元后,表現(xiàn)為綠色熒光增強,提示神經(jīng)元活性氧水平升高,但

10、淫羊藿苷干預后無變化。同時,總SOD結果也顯示,淫羊藿對皮質酮所致的海馬神經(jīng)元總SOD下降無逆轉效應。表明淫羊藿苷的保護作用可能與氧化應激無關。
　　 6.我們采用Western blot方法檢測ICA對皮質酮所致海馬神經(jīng)元損傷保護作用。在參照文獻基礎上,我們選擇了四個時間點30min,1h,2h,3h。結果顯示皮質酮作用于30min內顯著誘導了MAPK三個關鍵信號分子p38MAPK,ERK1/2和JNK的激活,且3h內持續(xù)激活

11、,用ICA預處理2h,抑制了p38MAPK的激活,且隨著作用時間的延長,其抑制作用越強。但是ICA對ERK1/2和JNK的激活無影響。結果顯示,ICA對皮質酮所致的海馬神經(jīng)元損傷有顯著的保護作用,并且在損傷的最初就顯示了良好的保護作用。
　　 7.我們采用western blot方法檢測ICA對皮質酮所致海馬神經(jīng)元損傷保護作用。在參照文獻基礎上,我們選擇了四個時間點30min,1h,2h,3h。結果顯示皮質酮作用于30min內顯

12、著抑制了P13K/Akt信號轉導通路中關鍵分子Akt的磷酸化,且3h內持續(xù)抑制,用ICA預處理2h,激活了AKT的磷酸化,且各個時間點無明顯差別。結果顯示,ICA對皮質酮所致的海馬神經(jīng)元損傷有顯著的保護作用,并且在損傷的最初就顯示了良好的保護作用。
　　 結論:
　　 1.淫羊藿苷對皮質酮誘導的原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元損傷具有保護作用,其可能與抑制神經(jīng)元凋亡、降低神經(jīng)元胞內鈣超載有關,但與神經(jīng)元的氧化應激無關。