大葉鉤藤藥學及藥理學實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 大葉鉤藤 Uncaria macrophylla Wall.屬于茜草科 Rubiaceae鉤藤屬Uncaria植物,《中華人民共和國藥典》2010年版收載,作為中藥正品鉤藤來源的一個種。大葉鉤藤主要分布于廣東、廣西、云南等省,具有清熱平肝、息風定驚之功效,是中醫(yī)臨床治療肝風內動,驚癇抽搐的常用中藥。
　　 作為中藥鉤藤,傳統(tǒng)的藥用部位是帶鉤莖枝,但最近的研究發(fā)現(xiàn)鉤藤葉這一部位的化學成分與帶鉤莖枝相似,并

2、且鉤藤葉遠比鉤藤帶鉤莖枝的產量高,可見鉤藤葉作為一種藥用資源,來源豐富,藥用價值及綜合利用潛力都很大。目前由于缺乏對鉤藤葉進行系統(tǒng)的藥學和藥理毒理學研究,使其一直沒有被開發(fā)利用,大量的鉤藤葉資源一直處于廢棄狀態(tài)。而在鉤藤屬藥用植物及近緣種中,大葉鉤藤葉的重量和產量最大。目前有關大葉鉤藤葉的藥理作用尚未見報道。
　　 研究目的：
　　 對大葉鉤藤進行資源調查,進行大葉鉤藤葉生藥學研究和主要化學成分測定,并在此基礎上,對大葉

3、鉤藤藥理作用進行初步研究,主要觀察其對中樞神經的影響和抗藥物依賴的作用,為該藥的進一步開發(fā)利用提供實驗依據。
　　 實驗方法：
　　 1.大葉鉤藤主要分布于華南及西南地區(qū)。應用植物分類學與植物地理學方法,就近選點,在粵西地區(qū)進行大葉鉤藤資源豐度,利用狀況及生態(tài)環(huán)境等方面的調查,并采集制作臘葉標本。
　　 2.生藥學鑒定方法:采集大葉鉤藤藥材標本,對鉤藤葉進行性狀鑒別,顯微鑒別采用石蠟切片法觀察葉片主脈及葉肉組織結

4、構、采用水合氯醛透化法觀察葉片粉末特征、采用表面撕片法觀察葉面氣孔及表皮細胞形態(tài),理化鑒別采用生物堿沉淀反應及硅膠薄層層析色譜法對大葉鉤藤中生物堿進行比較。
　　 3.主要化學成分測定:采用HPLC法測定大葉鉤藤不同部位有效成分鉤藤堿、異鉤藤堿含量,色譜柱為Hypersil ODS C18柱(4.6m×200mm,5um)；甲醇-水(含0.5％三乙胺,冰乙酸調PH6.334)=63:37為流動相,流速0.8ml·min-1,進樣

5、量為5.0μl,檢測波長為245nm,柱溫為室溫。
　　 4、大葉鉤藤對中樞神經系統(tǒng)的影響
　　 4.1小鼠自發(fā)活動實驗昆明種小鼠60只,雌雄各半,禁食12h,飲水不限。將小鼠隨機分為6組,即空白對照組(等容量生理鹽水組),陽性藥組(地西泮1mg/kg),鉤組(即大葉鉤藤帶鉤莖枝,下同)組(20g/kg)和大葉鉤藤葉低(5g/kg)、中(10g/kg)、高(20g/kg)三劑量組,每組10只動物。將各組小鼠放入YLS-I

6、A多功能小動物自主活動記錄儀中,適應5min后,測定小鼠給藥前的自主活動次數(shù),記錄時間為5min。記錄時室內保持安靜。然后按劑量給各組小鼠灌胃給藥。分別于給藥后30min、60min、120min各測定1次自發(fā)活動數(shù),記錄5min內各組小鼠的活動數(shù)。
　　 4.2戊巴比妥鈉閾下睡眠劑量誘導小鼠入睡試驗取昆明種小鼠55只,雌雄大致各半。將小鼠隨機分為5組,即空白對照組(等容量生理鹽水組),陽性藥組(地西泮1mg/kg),鉤組(即大

7、葉鉤藤帶鉤莖枝,下同)組(20 g/kg)和大葉鉤藤葉低(5g/kg)、高(20g/kg)劑量組,每組11只動物。按各組劑量給小鼠ig給藥,藥后60min后給每只小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉30mg/kg,以小鼠翻正反射消失1min以上為入睡標準,記錄1.5min內各組小鼠的入睡個數(shù)。
　　 4.3戊巴比妥鈉閾劑量誘導小鼠睡眠時間試驗取昆明種小鼠40只,雌雄各半,分組同上,每組8只動物。按各組劑量給小鼠ig給藥,藥后60min后給每只

8、小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉50mg/g,然后記錄各組小鼠的睡眠時間(以給藥后小鼠翻正反射消失為入睡時間,翻正反射消失至恢復為睡眠時間)。
　　 4.4硫酸士的寧致小鼠驚厥試驗:取昆明種小鼠75只,雌雄大致各半,分組同上,每組15只動物。按各組劑量給小鼠ig給藥,給藥后60min,腹腔注射硫酸士的寧(2mg/kg),記錄注射士的寧后2h內驚厥小鼠數(shù)和死亡小鼠數(shù),驚厥反應以小鼠出現(xiàn)四肢陣攣或強直性驚厥為指標。
　　 5.大葉鉤藤

9、對小鼠苯丙胺依賴位置偏愛效應(CPP)及腦內單胺遞質的影響
　　 取經過自然位置偏愛測定合格的SPF級昆明小鼠,按隨機分組原則分為①空白對照組,②苯丙胺模型組,③模型組+大葉鉤藤帶鉤莖枝組(20mg/kg),④模型組+大葉鉤藤葉高劑量組(20mg/kg),⑤模型組+大葉鉤藤葉低劑量組(5mg/kg),⑥大葉鉤藤純鉤組(20mg/kg),每組10只,雌雄各半。②～⑤組偶數(shù)天上午(8:00)腹腔注射(ip)苯丙胺(2 mg·kg-1

10、),奇數(shù)天上午(8:00)腹腔注射(ip)等體積生理鹽水,⑥組按相應劑量灌胃(ig)給予大葉鉤藤鉤提取物；③～⑤組于每日下午20:00(即給苯丙胺后12 h),分別按相應劑量灌胃(ig)給予大葉鉤藤提取物；①組以同體積生理鹽水替代苯丙胺給藥,其它處理同②組。整個過程共持續(xù)8d,實驗期間小鼠飲水進食自由。實驗時將位置偏愛箱中間的隔板放下,d1上午注射生理鹽水、苯丙胺及灌胃給予鉤藤堿后立即將小鼠置于白箱,d2上午注射及灌胃給予生理鹽水后立即

11、將小鼠置于黑箱,放置時間均為45min。以后的6 d均按上述方法操作,共8 d。在d9上午8:00(即最后一次給予苯丙胺24 h后)進行位置偏愛檢測,通過動物行為學分析系統(tǒng)記錄并分析小鼠15 min內在白箱中停留的時間。完成CPP測定后,立即將各組小鼠麻醉后快速斷頭處死,迅速剝取全腦,置液氮中冷凍1分鐘后,放于-80℃保存待測。測試時取小鼠大腦部分,稱重,勻漿,經離心等處理后制成樣品溶液,用熒光分光光度法測定樣品中NE、DA、5-HT的

12、含量。
　　 6.統(tǒng)計方法:應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據,實驗數(shù)據以 x±s表示,采用配對t檢驗、重復測量方差分析,單因素方差分析,先對數(shù)據進行方差齊性檢驗,方差齊則應用Anova法進行檢驗,用LSD法進行組間兩兩比較；如方差不齊,則應用近似方差分析的welch法進行檢驗,應用Dunnett's T3法進行兩兩比較。計數(shù)資料采用 x2檢驗。p<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1.對大葉

13、鉤藤進行資源調查發(fā)現(xiàn),廣東羅定西部蘊藏豐富的大葉鉤藤資源,當?shù)責o污染性工業(yè),生態(tài)環(huán)境優(yōu)良,植被保存比較完好,且有深厚的民間用藥文化背景,應積極保護資源并進一步合理開發(fā)利用。對大葉鉤藤葉進行生藥學研究結果發(fā)現(xiàn),大葉鉤藤葉葉片較大,含眾多單細胞非腺毛,柵欄組織細胞2—3列,葉片薄璧細胞含草酸鈣簇晶,平軸式氣孔,薄層層析顯示與鉤藤對照藥材至少有2種相同的生物堿成分。
　　 2、大葉鉤藤生物堿含量的HPLC結果表明,鉤藤堿和異鉤藤堿在0

14、.02μg～5μg范圍內線性關系良好,r鉤藤堿=0.9999,r異鉤藤堿=1.0000,平均回收率分別為98.52％和99.12％,RSD鉤藤堿=2.045％,RSD異鉤藤堿=2.171％。鉤藤堿含量大葉鉤藤葉為0.016％,大葉鉤藤帶鉤莖枝為0.015％,異鉤藤堿含量大葉鉤藤葉為0.006％,大葉鉤藤帶鉤莖枝為0.004％。3藥物對中樞神經系統(tǒng)的影響
　　 3.1藥物對小鼠自主活動的影響處理組之間采用重復測量方差分析,重復因素

15、四個水平數(shù)據不滿足球對稱假設(P=0.009),取 Greenhouse—Gelsser校正結果。處理組間差異有統(tǒng)計學意義(F=4.187,P=0.003),四個時間點間差異有統(tǒng)計學意義(F=71.010,P<0.001),時間因素和組別之間不存在交互效應(F=1.605,P=0.091)。在每一時間點上不同處理組間的差異采用 One—Way ANOVA,給藥前與藥后30min兩個時間點方差齊(P=0.238,0.215),六個處理組之

16、間差異無統(tǒng)計學意義(F藥前=2.209,P藥前=0.067；F藥后30min=0.987,P藥后30min=0.434)；藥后60min方差齊(P=0.102),六個處理組之間差異有統(tǒng)計學意義(F=3.346,P=0.009),空白組均高于其余五組(P=0.009,0.001,0.001,0.002,0.008),其余五組之間差異無統(tǒng)計學意義(P值均大于0.05)；藥后120min方差齊(P=0.199),六個處理組之間差異有統(tǒng)計學意義

17、(F120min=3.538,P120min=0.008),空白組均高于帶鉤莖枝組、陽性藥組、葉低劑量組、葉高劑量組(P<0.001,P=0.004,0.017,0.005)。每一組在不同時間點上活動次數(shù)的差異用重復測量方差分析,空白組在各時間點上數(shù)據不滿足球對稱假設(P=0.022),取Greenhouse—Geisser校正結果,四個時間點間差異有統(tǒng)計學意義(F=4.010,P=0.018)；至藥后60分鐘與給藥前差異有統(tǒng)計學意義;

18、陽性藥組數(shù)據滿足球對稱假設(P=0.077),四個時間點間差異有統(tǒng)計學意義(F=9.261,P<0.001);至藥后60分鐘與給藥前差異有統(tǒng)計學意義。帶鉤莖枝組、葉低劑量組、葉中劑量組、葉高劑量組數(shù)據均滿足球對稱假設(P=0.179,0.865,0.085,0.294),四個時間點間差異有統(tǒng)計學意義(F=11.901,P<0.001；F=17.515,P<0.001;F=21.998,P<0.001；F=14.332,P<0.001),

19、均至藥后30分鐘與給藥前差異有統(tǒng)計學意義?？偟膩碚f,小鼠的活動次數(shù)在給藥前后不同時間之間有差異,六組均在給藥前達到最大值,除空白組外其余五組給藥后活動次數(shù)隨時間呈下降趨勢,至120min達到最小值。帶鉤莖枝組以及葉各劑量組于30分鐘即與給藥前差異有統(tǒng)計學意義,陽性藥組至藥后60分鐘與給藥前差異有統(tǒng)計學意義,大葉鉤藤組起效時間較快。
　　 3.2戊巴比妥鈉閾下睡眠劑量誘導小鼠入睡實驗空白對照組在腹腔注射閾下睡眠劑量的戊巴比妥鈉(3

20、0mg/kg)后,翻正反射消失小鼠為0只,陽性藥組有6只小鼠入睡,鉤組有7只小鼠入睡,葉低劑量組有5只小鼠入睡,高劑量組有4只小鼠入睡。由于有50％格子理論頻數(shù)小于5,取 Fisher確切概率法結果,P=0.015,差異有統(tǒng)計學意義,可認為5個實驗組之間的差異有統(tǒng)計學意義。
　　 3.3戊巴比妥鈉閾劑量誘導小鼠睡眠時間實驗各組小數(shù)睡眠時間數(shù)據經One—Way ANOVA分析表明組間有差異有統(tǒng)計學意義(F=5.676,P=0.00

21、1),需進一步兩兩比較(采用 LSD法)?？瞻讓φ战M與鉤藤葉低劑量組、帶鉤莖枝組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.959,P=0.274),與陽性藥組、葉高劑量組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.004,P=0.001)。結果表明,葉高劑量組可使戊巴比妥鈉閾劑量所致小鼠睡眠持續(xù)時間延長,且與陽性藥組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.569)
　　 3.4藥物對硫酸士的寧致小鼠驚厥作用的影響給小鼠腹腔注射士的寧(2mg/g)后,小鼠在5min內出

22、現(xiàn)強直性驚厥和死亡。各組小鼠存活個數(shù)經 X2檢驗,50％格子數(shù)小于5,取Fisher確切概率法結果,P=0.133,差異無統(tǒng)計學意義,可認為5個實驗組之間的小鼠驚厥個數(shù)差異無統(tǒng)計學意義。各組小鼠驚厥時間經One—Way ANOVA分析,levene檢驗方差不齊,用近似 F檢驗 Welch法,P=0.003,組間差異有統(tǒng)計學意義,經兩兩比較,陽性藥組與空白對照組、帶鉤莖枝組、高劑量組比較差異有統(tǒng)計學意義,其余四組間差異無統(tǒng)計學意義,葉低劑

23、量組與陽性藥組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.142),但與其余3組比較亦差異無統(tǒng)計學意義,尚不能認為它們之間藥效相似。
　　 4.藥物對小鼠苯丙胺依賴位置偏愛效應(CPP)的影響給藥前各組數(shù)據方差不齊(P=0.022),取 Welch結果 P=0.309,差異有統(tǒng)計學意義。空白對照組小鼠給藥前后在伴藥箱中的停留時間無明顯變化(P=0.162)。與給藥前比較,模型組小鼠給藥后在伴藥箱中的停留時間明顯延長(P=0.002)。表明模型

24、組小鼠對白箱產生CPP,小鼠苯丙胺CPP模型建立成功。與給藥前比較,低劑量組、高劑量組、帶鉤莖枝組、純鉤組小鼠給藥后在伴藥箱中的停留時間差異無統(tǒng)計學意義。與空白對照組比較,模型組小鼠給藥后在伴藥箱中的停留時間明顯延長(P=0.001)；而鉤藤堿低劑量組及高劑量組小鼠給藥后在伴藥箱中的停留時間與之比較無明顯差異。帶鉤莖枝組、低劑量組帶鉤莖枝組、純鉤組給藥后在白箱中的停留時間與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001,P=0.006,P<

25、0.001)。用 One-Way ANOVA對各組單胺神經遞質含量測定結果進行分析,各組 NE、DA、5-HT數(shù)據方差齊(P=0.738,P=0.120,P=0.072)、各組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001,P<0.001,P=0.033)。用LSD進行多重比較,與空白對照組比較,模型組 NE、DA含量均升高(P<0.001),5-HT含量降低(P=0.033)；模型+鉤組NE含量升高(P=0.044)。純鉤組、模型+鉤組、模型

26、+高、低劑量組NE含量低于模型組(P<0.001)；純鉤組、模型+鉤組、模型+高、低劑量組DA含量低于模型組(P=0.002、P<0.001、P=0.001、P<0.001)；純鉤組、模型+鉤組5-HT含量高于模型組(P=0.002、P=0.01)；模型+高劑量組、模型+低劑量組的5-HT含量與模型組比較有升高趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.169,P=0.069)。
　　 結論：
　　 1、大葉鉤藤資源豐富,大葉鉤藤

27、葉的性狀鑒別和顯微特征均具有形態(tài)學規(guī)律,可作為對其進行生藥鑒定的實驗依據。生物堿沉淀反應和薄層層析色譜分析結果表明,大葉鉤藤葉與鉤藤對照藥材在生物堿方面至少有兩種相同的成分。
　　 2.大葉鉤藤中鉤藤堿與異鉤藤堿含量較高,本HPLC法準確,操作簡便、快速,重復性較好,精密度較高,可用于對鉤藤屬植物的總生物堿以及有效成分鉤藤堿、異鉤藤堿含量的測定。
　　 3、大葉鉤藤醇提物能夠顯著降低小鼠的自主活動,增加翻正反射消失的小鼠

28、數(shù),延長小鼠睡眠時間。但不能減少硫酸士的寧引起的驚厥小鼠的死亡數(shù)以及硫酸士的寧致小鼠驚厥的潛伏時間。
　　 4.苯丙胺能使受試動物產生明顯的位置偏愛效應,小鼠于伴藥箱中停留時間延長。大葉鉤藤可以縮短成癮小鼠在伴藥箱中的停留時間,抑制苯丙胺小鼠依賴狀態(tài)下的CPP效應,使之與正常小鼠差異無統(tǒng)計學意義。而正常小鼠給予大葉鉤藤并不會產生CPP,說明其本身并無成癮性。遞質含量測定結果顯示,模型組小鼠大腦區(qū)DA、NE、5-HT含量均有異于空