TAp63α基因在BMP9誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、在進(jìn)行骨折不連接、骨缺損和脊柱融合術(shù)治療時(shí)，采取骨移植的治療手段是臨床上所必需的。而在進(jìn)行傳統(tǒng)治療后，新骨產(chǎn)生并替代的過程會(huì)耗上數(shù)月甚至數(shù)年，而且治愈后還會(huì)常發(fā)生再次骨連接不良、發(fā)生缺損等后遺癥，影響植骨效果。迄今為止，骨移植開始從植骨支架、能夠分化成為骨組織的干細(xì)胞和參與干細(xì)胞成骨分化的細(xì)胞因子三方面著手來(lái)避免骨移植治療的失敗。目前，植骨支架多使用Ⅰ型膠原，此膠原成海綿狀，對(duì)改善骨移植效果明顯;同時(shí)，已經(jīng)被人們所發(fā)現(xiàn)和使用的間充質(zhì)干細(xì)

2、胞使成骨種子細(xì)胞問題得以解決，但是由于間充質(zhì)干細(xì)胞能向多種細(xì)胞系分化，因此尋找特定的細(xì)胞因子能夠使間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化成為成骨細(xì)胞成為目前該領(lǐng)域研究探索的熱點(diǎn)。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于結(jié)締組織和多種器官間質(zhì)中的多功能干細(xì)胞，其在特定的刺激下可以分化成為成骨細(xì)胞。而TGF-β超家族成員之一骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogenetic proteins，BMPs)可以誘

3、導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化成為成骨細(xì)胞，目前至少存在20多種BMPs，并且目前為止，研究發(fā)現(xiàn)BMP9的成骨誘導(dǎo)能力是最強(qiáng)的。已有研究表明，BMP9可以通過激活其下游的經(jīng)典信號(hào)通路BMPs-Smad信號(hào)通路和一些非經(jīng)典信號(hào)通路(例如MAPK、Wnt、PI3K/AKT)等來(lái)誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，但目前對(duì)BMP9的上游調(diào)控因子了解甚少。
　　本課題希望通過探討腫瘤抑制因子p53家族中的p63轉(zhuǎn)錄因子對(duì)BMP9及其信號(hào)的調(diào)控進(jìn)行進(jìn)一步探索，試

4、圖進(jìn)一步解釋BMP9具有很強(qiáng)誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨的作用機(jī)制，為BMP9誘導(dǎo)成骨分化的分子機(jī)制提供更深的理論依據(jù)。
　　目的:
　　(1) p63基因是否與BMP9存在相互聯(lián)系，p63是否為BMP9的上游調(diào)控基因;(2) p63基因在BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的作用;(3) p63在BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中發(fā)揮作用可能的作用機(jī)制。
　　方法:
　　第一部分:首先通過AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建p63的

5、全長(zhǎng)亞型TAp63α和顯性負(fù)性突變亞型△Np63α的重組腺病毒，然后將AdTAp63α兩種腺病毒分別感染iMefs細(xì)胞以及p63-/-的iMefs細(xì)胞，通過PCR方法檢測(cè)在細(xì)胞過表達(dá)TAp63α的情況下BMP9 mRNA水平的變化。同時(shí)通ChIP的方法檢測(cè)p63是否是BMP9的上游調(diào)控因子，是否與BMP9的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子結(jié)合對(duì)BMP9的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，并且在2周齡的C57小鼠的長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板中檢測(cè)是否有p63蛋白的表達(dá)。
　　第二部分:在體

6、外實(shí)驗(yàn)中，首先通過檢測(cè)早期成骨指標(biāo)堿性磷酸酶(ALP)活性的變化來(lái)驗(yàn)證TAp63α是否會(huì)促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。相反，△Np63α是否會(huì)抑制BMP9誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。然后通過茜素紅S染色以及免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)骨橋蛋白(OPN)和骨鈣素(OCN)表達(dá)的變化來(lái)驗(yàn)證TAp63α或者△Np63α是否會(huì)影響B(tài)MP9誘導(dǎo)的成骨晚期標(biāo)志物的表達(dá)。隨后通過半定量PCR和定量PCR的方法來(lái)檢測(cè)TAp63α、△Np63

7、α對(duì)BMP9下游與成骨分化相關(guān)基因Osterix和Runx2表達(dá)的影響。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，先將AdTAp63α、Ad△Np63α和AdBMP9分別或同時(shí)感染iMEFs細(xì)胞，然后將細(xì)胞收集起來(lái)對(duì)裸鼠進(jìn)行皮下和肌肉內(nèi)注射，一個(gè)月后取出包塊進(jìn)行microCT掃描，HE染色、Masson's Trichrome染色以及Alcianblue染色來(lái)檢測(cè)TAp63α、△Np63α是否對(duì)BMP9誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)異位成骨分化產(chǎn)生影響。
　　第

8、三部分:通過MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)分析TAp63是否會(huì)影響B(tài)MP9對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的調(diào)控而影響細(xì)胞的分化。另一方面，通過免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)TAp63是否會(huì)通過BMP9下游的信號(hào)通路及其定位來(lái)影響B(tài)MP9對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的分化的誘導(dǎo)效果。
　　結(jié)果:
　　通過第一部分實(shí)驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)，p63蛋白在2周大小的C57小鼠長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板的軟骨細(xì)胞區(qū)域有所表達(dá)，并且在iMEFs(mouse embryonicfibroblas

9、ts，MEFs)細(xì)胞過表達(dá)TAp63α和向p63-/-的MEFs補(bǔ)回p63基因后，發(fā)現(xiàn)TAp63α能夠促進(jìn)BMP9基因的表達(dá)，有趣的是，當(dāng)細(xì)胞過表達(dá)BMP9后，TAp63α的表達(dá)反而下降，這間接說(shuō)明p63可能為BMP9的上游調(diào)控基因，而BMP9的過表達(dá)會(huì)造成對(duì)p63的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。同時(shí)，通過ChIP Assay，我們發(fā)現(xiàn)TAp63α可以與BMP9基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子結(jié)合，這進(jìn)一步說(shuō)明p63與BMP9不但存在相互作用，而且p63是BMP9的上游

10、調(diào)控基因。
　　通過第二部分實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TAp63α能夠在體外促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)的早期成骨指標(biāo)堿性磷酸酶(ALP)的活性，同時(shí)還能促進(jìn)晚期成骨指標(biāo)鈣鹽的沉積以及骨橋蛋白(OPN)和骨鈣素(OCN)表達(dá)，協(xié)同BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。同時(shí)，TAp63α還能促進(jìn)BMP9下游成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄基因Osterix和Runx2的表達(dá)。由于△Np63α是p63的顯型負(fù)性突變亞型，通過實(shí)驗(yàn)證明其作用與TAp63α相反，對(duì)BMP99的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞

11、成骨分化起拮抗作用。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，TAp63α能夠促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)的皮下包塊以及肌肉包塊的骨組織面積的增大以及骨組織成熟度的增加，而與體外實(shí)驗(yàn)一致，△Np63α的作用相反。這些結(jié)果說(shuō)明，p63α可作為BMP9的上游調(diào)控基因能夠促進(jìn)BMP9的成骨誘導(dǎo)作用。
　　在第三部分實(shí)驗(yàn)中，通過MTT實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)TAp63α抑制BMP9促進(jìn)的細(xì)胞增殖，同時(shí)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMP9誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化過程中各組細(xì)胞周期的變化，我們發(fā)現(xiàn)在

12、細(xì)胞同時(shí)感染了AdBMP9和AdTAp63α后24小時(shí)和48小時(shí)分別都檢測(cè)到TAp63α能夠促進(jìn)G0/G1期細(xì)胞數(shù)量的增多，S期細(xì)胞數(shù)量減少，這提示TAp63α對(duì)BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的促進(jìn)作用可能與其能增加G0/G1期細(xì)胞的比例抑制細(xì)胞增殖促進(jìn)細(xì)胞分化有關(guān)。通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法發(fā)現(xiàn)TAp63α可以促進(jìn)BMP9的經(jīng)典信號(hào)通路中Smad1/5/8信號(hào)分子的磷酸化以及BMP9非經(jīng)典信號(hào)途徑p38MAPK和PI3K/Akt中