PP4C在人腦膠質(zhì)瘤中的表達、功能及其相關(guān)調(diào)控機制研究.pdf

1、本研究共分為三部分。第一部分，應用Western Blot、Real-time PCR和免疫組織化學檢測PP4C在膠質(zhì)瘤中的表達，并分析PP4C的異常表達與膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征及預后的相關(guān)性。第二部分，檢測人膠質(zhì)瘤細胞系A(chǔ)172、U251、U87和正常膠質(zhì)細胞Astrocyte中PP4C的表達，并探討沉默PP4C基因?qū)θ四X膠質(zhì)瘤細胞系U251、U87增殖、遷移和侵襲的影響。第三部分，應用生物信息軟件預測調(diào)控PP4C的潛在miRNA，即

2、miR-128-3p，通過熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步驗證其真實性:并用Westem Blot及Real-time PCR檢測miR-128-3p對PP4C蛋白及mRNA的影響;進一步在膠質(zhì)瘤組織中檢測miR-128-3p的表達，并分析其與PP4C的相關(guān)性。
　　第一部分 PP4C在人腦膠質(zhì)細胞瘤組織中表達及其臨床病理特征相關(guān)性研究
　　目的:
　　1.探討PP4C蛋白和mRNA在人腦膠質(zhì)細胞瘤組織和正常腦組織的表達情況

3、。
　　2.探討PP4C異常表達與膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征及預后的相關(guān)性。
　　方法:
　　1.采用Western Blot和Real-time PCR和檢測PP4C蛋白和mRNA在新鮮膠質(zhì)細胞瘤組織及正常腦組織中的表達。
　　2.采用免疫組織化學方法檢測120例腦膠質(zhì)瘤組織及10例正常腦組織中PP4C蛋白表達情況及分析其表達與膠質(zhì)瘤WHO病理級別的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.PP4C蛋白和mRNA在

4、腦膠質(zhì)瘤組織中的表達顯著高于正常腦組織。并且PP4C蛋白和mRNA表達隨WHO病理級別增高有逐漸升高的趨勢，與膠質(zhì)瘤的惡性程度相關(guān)。
　　2.PP4C陽性表達為細胞核和胞漿染成淺黃色、棕黃色或者黃褐色。PP4C蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織的高表達率為60％(72/120)，在10例正常腦組織中PP4C均呈低表達。除此之外，PP4C蛋白在Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級膠質(zhì)瘤的高表達率分別為21.43％(6/28)、55.56％(20/36)、82.14％(

5、46/56)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。Kaplan-Meier生存分析表明PP4C高表達的患者預后比PP4C低表達的患者預后差。Cox比例風險模型進行單因素、多因素分析顯示PP4C蛋白高表達是影響膠質(zhì)瘤患者預后的獨立危險因素。
　　結(jié)論:
　　PP4C蛋白和mRNA在膠質(zhì)瘤中的表達與正常腦組織相比顯著增高，并與膠質(zhì)瘤病理分級相關(guān):預后分析表明PP4C高表達是膠質(zhì)瘤患者的預后獨立危險因素。
　　第二部分 P

6、P4C在人膠質(zhì)瘤細胞系中的表達及沉默PP4C基因?qū)毎鲋?、遷移和侵襲的影響
　　目的:
　　1.探討人膠質(zhì)瘤細胞系A(chǔ)172、U251、U87及正常膠質(zhì)細胞Astrocyte中PP4C的表達情況。
　　2.探討沉默PP4C基因?qū)θ四X膠質(zhì)瘤細胞系U251、U87增殖、遷移和侵襲的影響。
　　方法:
　　1.采用Western Blot和Real-time PCR和檢測PP4C蛋白和mRNA在人膠質(zhì)瘤細胞系及正

7、常膠質(zhì)細胞中的表達情況。
　　2.si-RNA的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染:設計合成PP4C-siRNA干擾序列，并實驗將U251和U87細胞株各分成兩組，即實驗組（轉(zhuǎn)染PP4C-siRNA）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染非特異性siRNA），用轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染。
　　3.PP4C基因沉默效率的檢測:使用Real-time PCR和Western Blot檢測PP4C-siRNA沉默效率。
　　4.采用CCK-8及EdU實驗檢測沉默PP4C基因后

8、U251、U87細胞的增殖能力變化。
　　5.采用劃痕實驗檢測沉默PP4C基因后U251、U87細胞遷移能力的變化。
　　6.采用Transwell實驗檢測沉默PP4C基因后U251、U87細胞侵襲能力的變化。
　　結(jié)果:
　　1.PP4C在腦膠質(zhì)瘤細胞系中的表達
　　應用Western Blot及Real-time PCR檢測膠質(zhì)瘤細胞系A(chǔ)172、U251、U87及正常膠質(zhì)細胞Astrocyte結(jié)果顯示，

9、PP4C蛋白及mRNA在4種細胞系中均存在表達，在U251、U87細胞中相對表達量較高，A172細胞次之，Astrocyte中相對表達量最低，因此篩選出U251、U87優(yōu)勢表達細胞系進行下一步實驗。
　　2.檢測PP4C-siRNA的沉默效率
　　使用Real-time PCR和Western Blot檢測PP4C-siRNA沉默效率。Real-timePCR及Western Blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48小時后，相對于陰性對照

10、組，PP4C-siRNA明顯降低膠質(zhì)瘤細胞系U251、U87中PP4C mRNA及蛋白的表達（P均＜0.01）。
　　3.PP4C基因沉默對U251、U87細胞系增殖能力的影響
　　CCK-8增殖實驗結(jié)果表明，與陰性對照組(NC)相比，P4C-siRNA實驗組U251、U87細胞增值率顯著降低，分別降低了54％、50％，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。EdU增殖實驗結(jié)果表明，與陰性對照組(NC)相比，PP4C-siRN

11、A實驗組細胞增殖率顯著降低，U251、U87細胞分別降低了51％、64％，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。這些結(jié)果表明，PP4C可以促進膠質(zhì)瘤細胞的體外增殖能力，沉默PP4C后膠質(zhì)瘤細胞的增殖明顯降低。
　　4.PP4C基因沉默對U251、U87細胞系遷移能力的影響
　　劃痕實驗結(jié)果顯示，相對于陰性對照組，PP4C-siRNA組細胞遷移數(shù)明顯下降，其中U251細胞減少了56％，U87細胞減少了66％，差異具有統(tǒng)計學意義(

12、P＜0.01)。
　　5.PP4C基因沉默對U251、U87細胞系侵襲能力的影響
　　Transwell侵襲實驗結(jié)果表明，與陰性對照組(NC)相比，PP4C-siRNA實驗組穿過小室結(jié)晶紫染色細胞顯著減少，其中U251細胞減少了52％，U87細胞減少了39％，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.PP4C在膠質(zhì)瘤細胞株中高表達，并篩選出U251、U87優(yōu)勢細胞株進行后續(xù)生物學實驗。
　　

13、2.PP4C siRNA可以明顯沉默PP4C的表達，并可以抑制U251、U87細胞的增殖、遷移及侵襲能力。表明PP4C可以促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力。
　　第三部分 miR-128-3p與PP4C基因的靶向調(diào)控關(guān)系研究
　　目的:
　　1.預測可能調(diào)控PP4C的潛在miRNA。
　　2.驗證miR-128-3p是否轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控PP4C的表達。
　　3.檢測miR-128-3p在膠質(zhì)瘤組織中的表達

14、，并分析miR-128-3p與PP4C表達相關(guān)性。
　　方法:
　　1.采用靶基因預測算法對調(diào)控PP4C的潛在miRNA進行生物信息學預測，分析PP4C的3'-UTR區(qū)域存在miR-128-3p的結(jié)合位點。
　　2.利用熒光素酶報告基因?qū)嶒炘?93T細胞中驗證miR-128-3p與PP4C是否存在直接相互作用，進一步在膠質(zhì)瘤細胞系U251、U87中驗證miR-128-3p與PP4C是否存在直接相互作用。
　　3.

15、miR-128-3p mimics、miR-NC mimics轉(zhuǎn)染U251、U87細胞，分別利用WesternBlot和Real-time PCR檢測PP4C的蛋白和mRNA水平。
　　4.Real-time PCR檢測miR-128-3p在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達，并分析miR-128-3p與PP4C表達相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.生物信息學預測軟件顯示在PP4C的3'-UTR區(qū)域存在miR-128-3p的結(jié)合位點。<

16、br>　　2.首先在293T細胞中，miR-128-3p能直接與PP4C3'-UTR上的結(jié)合位點結(jié)合從而抑制熒光素酶表達。其次，miR-128-3p可以在U251和U87細胞中可以與PP4C3'-UTR結(jié)合從而抑制熒光素酶活性，從而驗證了miR-128-3p與PP4C的直接相互作用，PP4C是miR-128-3p的直接靶基因。
　　3.48小時后，轉(zhuǎn)染miR-128-3p過表達miR-128-3p U251、U87細胞中PP4C蛋

17、白水平相比與轉(zhuǎn)染NC的U251、U87細胞是顯著降低的，而膠質(zhì)瘤U251和U87細胞中過表達miR-128-3p后，PP4C mRNA水平?jīng)]有顯著變化。預示PP4C作為miR-128-3p的直接靶基因，并被其負調(diào)控。
　　4.miR-128-3p在膠質(zhì)瘤中的表達水平顯著低于正常腦組織。并且發(fā)現(xiàn)miR-128-3p的表達水平隨著膠質(zhì)瘤病理級別的增高逐漸降低。在膠質(zhì)瘤組織中，miR-128-3p的表達水平與PP4C蛋白表達水平呈顯著負