疾病代謝物的色譜-質(zhì)譜分析方法研究.pdf

1、近年來，隨著人類基因組測序工作的完成，人們對生命過程的理解有了很大的提高；人類越來越關(guān)注自身的健康狀況以及生命質(zhì)量。在科學(xué)領(lǐng)域，研究的熱點(diǎn)也由此轉(zhuǎn)移到基因的功能和幾個(gè)“組學(xué)”研究，包括研究核糖核酸(RNA)轉(zhuǎn)錄過程的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、研究某個(gè)過程中所有蛋白及其功能的蛋白組學(xué)、研究代謝產(chǎn)物的變化及代謝途徑的代謝組學(xué)。
　　 代謝組學(xué)是繼“基因組學(xué)”、“轉(zhuǎn)錄組學(xué)”、“蛋白組學(xué)”之后新興的又一門“組學(xué)”研究。代謝物組中，有一類異常新陳代謝物與

2、疾病息息相關(guān)。正如大自然中生物個(gè)體之間和生物體內(nèi)部的化學(xué)聯(lián)系是一個(gè)普遍規(guī)律，人體內(nèi)部也時(shí)刻通過生物化學(xué)信號物質(zhì)進(jìn)行聯(lián)系。當(dāng)人體發(fā)生疾病時(shí)，新陳代謝相應(yīng)出現(xiàn)異常，血液、尿液、組織以及呼吸氣體中會相應(yīng)出現(xiàn)異常代謝物，而疾病化學(xué)標(biāo)志物顧名思義就是可以作為指針與疾病各個(gè)病理階段相關(guān)聯(lián)。分析這些疾病相關(guān)的化學(xué)信號物質(zhì)已經(jīng)成為臨床診斷疾病的一種重要手段。生物醫(yī)學(xué)研究結(jié)合分析化學(xué)、生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等學(xué)科進(jìn)行人類重大疾病的篩查、診斷、治療已成為當(dāng)前研究的

3、熱點(diǎn)。發(fā)展色譜質(zhì)譜新技術(shù)新方法發(fā)現(xiàn)并分析人體生物化學(xué)信號物質(zhì)對重大疾病進(jìn)行篩查和預(yù)警已經(jīng)成為其重要的方向之一。
　　 本論文以重大疾病(糖尿病、肺癌、新生兒遺傳代謝疾病等)血液和組織中疾病化學(xué)標(biāo)志物分離和鑒定為研究內(nèi)容。該研究有十分重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。對肺癌病人的血液進(jìn)行固相微萃取GC-MS頂空分析，發(fā)現(xiàn)并論證肺癌標(biāo)記物分子，為肺癌開辟了一條新的、能夠用于早期診斷的途徑；并進(jìn)一步發(fā)展了液滴衍生微萃取技術(shù)與GC-MS聯(lián)用技術(shù)，分

4、析癌癥以及新生兒遺傳代謝疾病病人血液、尿液中小分子代謝物，首次發(fā)現(xiàn)了癌癥潛在早期標(biāo)志物--己醛和庚醛；通過肝病不同階段的病理模型以及隨訪跟蹤病人，運(yùn)用該方法進(jìn)一步論證了己醛和庚醛作為癌癥早期預(yù)警信號物質(zhì)的作用。而對于新生兒遺傳性有機(jī)酸尿癥，我國兒童醫(yī)學(xué)在新生兒篩查此類病癥方面一直處于空白，我們運(yùn)用了液滴微萃取技術(shù)與GC-MS聯(lián)用，應(yīng)用于幾類典型的新生兒有機(jī)酸尿癥研究，結(jié)果表明該方法快速簡便，定量準(zhǔn)確，是潛在的臨床早期篩查手段。
　

5、　 本論文共分四章。主要內(nèi)容摘要如下：
　　 第一章論述了代謝組學(xué)的定義、研究范疇以及在藥學(xué)、微生物學(xué)、毒理學(xué)、臨床學(xué)等各方面的廣泛應(yīng)用與重要性。闡述了人體疾病信號物質(zhì)研究對于重大疾病早期診斷和預(yù)警的理論和實(shí)際意義。此外還綜述了疾病化學(xué)信號物質(zhì)的分析方法，復(fù)雜體系樣品前處理的方法以及建立合適動態(tài)模型的重要性和必要性。提出了本論文的研究目標(biāo)和選題意義。
　　 第二章的工作中，首先發(fā)展了色譜質(zhì)譜技術(shù)分析重大癌癥以及肝病的生

6、物標(biāo)志物，初步建立了早期篩查與預(yù)警癌癥與肝病的簡單、可靠的方法。發(fā)展了頂空固相微萃取方法分析病人血樣中揮發(fā)性小分子代謝物；針對小分子羰基化合物，比較多種衍生試劑，進(jìn)一步發(fā)展了定量分析小分子醛酮化合物的原位衍生化固相微萃取GC-MS方法，首次發(fā)現(xiàn)了癌癥病人血液中己醛與庚醛含量異常，為正常人血液中含量的10倍以上，我們認(rèn)為己醛與庚醛為癌癥病人體內(nèi)代謝異常的標(biāo)志指針。我們通過建立不同階段肝病病癥的病人模型，動態(tài)跟蹤隨訪病人，分析病人血液中小分

7、子醛酮的含量，進(jìn)而驗(yàn)證了己醛及庚醛與癌癥的相關(guān)性。衍生固相微萃取與GC-MS方法聯(lián)用，具有快速、無害、簡單、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，解決了傳統(tǒng)方法難以準(zhǔn)確定量分析揮發(fā)性強(qiáng)的小分子羰基化合物的問題。
　　 第三章在第二章原位衍生固相微萃取技術(shù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)展了液滴衍生微萃取技術(shù)與GC-MS聯(lián)用分析重大疾病血樣中小分子羰基化合物。論文首先綜述了近年來液液(微)萃取技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，設(shè)計(jì)了簡便的液滴微萃取設(shè)備并與固相微萃取技術(shù)進(jìn)行比較，兩者各

8、有其優(yōu)缺點(diǎn)。固相微萃取無需有機(jī)溶劑、對環(huán)境友好，但缺點(diǎn)是成本較高、萃取頭容易損壞、進(jìn)樣易殘留；液滴微萃取技術(shù)與其相比優(yōu)點(diǎn)是成本低廉、毒性溶劑僅使用微升級別可忽略不計(jì)，集萃取、衍生、進(jìn)樣于一步驟，缺點(diǎn)則是與固相微萃取相比操作需要訓(xùn)練，該方法適用于大量樣本篩查，大大降低成本。本章發(fā)展了一系列液滴萃取方法：(1)液滴微萃取溶液內(nèi)衍生化-GC/MS分析癌癥病人血液中羰基化合物，試驗(yàn)結(jié)果與固相微萃取技術(shù)可較好吻合，檢測限略高，但足夠滿足血樣中實(shí)際

9、濃度分析。(2)液滴內(nèi)衍生微萃取-GC/MS分析癌癥病人羰基化合物標(biāo)志物，將衍生試劑先溶入萃取試劑，使得衍生反應(yīng)在液滴溶劑內(nèi)發(fā)生，試驗(yàn)結(jié)果論證該方法的重現(xiàn)性、回收率更加良好。(3)靜態(tài)頂空液滴微萃取與動態(tài)頂空液滴微萃取分析技術(shù)比較，理論預(yù)測動態(tài)萃取方法的相相接觸更為完全，萃取效率更好，但是試驗(yàn)論證由于操作的難度較大，動態(tài)過程中液滴溶劑容易損失，該方法檢測限確實(shí)降低，但是重現(xiàn)性比較差。總體而言，對于重大疾病的生物標(biāo)志物分析，固相微萃取和液

10、滴微萃取都可以很好的達(dá)到分析目的，可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇。
　　 第四章主要針對幾類重要的新生兒有機(jī)酸尿癥的信號物質(zhì)進(jìn)行研究分析。由于我國目前醫(yī)療水平還未達(dá)到發(fā)達(dá)國家水平，新生兒有機(jī)酸尿癥的胎檢以及出生篩查基本屬于空白。然而遺傳性有機(jī)酸尿癥在早期基本沒有明顯病癥，患者在生長過程中會伴隨著發(fā)育緩慢、腦發(fā)育不健全、神經(jīng)性疾病等一系列復(fù)雜病癥，因而對于有機(jī)酸尿癥研究發(fā)展適合新生兒篩查的新技術(shù)新方法勢在必行。本章通過尋找合適的衍生試劑，