姜黃素抑制脊髓損傷后膠質瘢痕形成的機制及其對神經再生的影響.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)引起的神經功能缺失和缺乏有效的治療手段，一直是對人類健康的極大挑戰(zhàn)。脊髓損傷后，膠質瘢痕修復損傷部位，但過度增生的瘢痕組織被認為是阻礙軸突再生的重要原因，且與炎癥細胞的激活以及抑制性細胞外基質的分泌密切相關。星形膠質細胞受到炎癥因子激活后形成反應性膠質細胞增生并導致膠質瘢痕的形成，膠質瘢痕又可以分泌炎癥因子和細胞外抑制性基質成分，加重了繼發(fā)性損傷，導致惡性循環(huán)。因此，抑制膠質瘢痕的

2、形成是提高脊髓損傷神經功能恢復的重要策略。
　　取自姜科姜黃屬多年生草本植物姜黃干燥梗莖中的姜黃素(curcumin，cur)，作為香料和食用色素很早就得到了廣泛應用。大量的研究證實，姜黃素能通過調節(jié)轉錄因子、生長因子、趨化因子、炎癥因子和酶等發(fā)揮抗炎、抗纖維化、抗腫瘤等生物學功能。我們前期的研究發(fā)現姜黃素可以抑制膠質瘢痕的形成，但其作用機制和作用靶點仍需要進一步探討。
　　炎癥反應是導致繼發(fā)性脊髓損傷的重要因素。小膠質細胞

3、作為中樞神經系統(tǒng)常駐免疫細胞，在脊髓損傷后迅速激活并持續(xù)分泌促炎因子，是介導脊髓損傷后炎癥反應的重要成分。抑制小膠質細胞的激活可以顯著提高實驗動物脊髓損傷后運動功能的恢復。姜黃素能抑制顱腦損傷后的小膠質細胞的活性，但其在脊髓損傷后小膠質細胞活化中的作用缺乏深入的研究。炎癥反應還和神經干細胞(neural stem/progenitor cells，NSPCs)的增殖與分化密切相關。抑制炎癥反應可以促進NSPCs分化為神經元和少突膠質細胞

4、。
　　基于以上理論，我們進行了如下假設:姜黃素能抑制星形膠質細胞和小膠質細胞介導的炎癥反應，脊髓損傷后其發(fā)揮強大的抗炎作用，有助于脊髓損傷后神經功能恢復。控制脊髓損傷的炎癥反應能改善NSPCs生長的環(huán)境，這對NSPCs分化為神經元和少突膠質細胞具有積極作用。本課題從以下幾個方面進行了研究。
　　一.姜黃素抑制脊髓損傷后膠質瘢痕形成
　　目的：
　　脊髓損傷能激活膠質細胞并使其腫脹、增殖，形成反應性膠質細胞增生，

5、嚴重壓縮了神經生長的空間。膠質細胞還會分泌大量抑制性細胞外基質，改變軸突生長的微環(huán)境。這些共同作為膠質瘢痕的抑制因素，嚴重阻礙了神經再生。本研究通過建立脊髓損傷模型后給予姜黃素干預，檢測其對膠質瘢痕的作用。
　　方法:
　　1.采用SD大鼠建立脊髓夾傷模型，給予不同濃度姜黃素(300mg/kg、100 mg/kg、30 mg/kg)連續(xù)干預7天，并以甲基強的松龍作為對照;
　　2.在損傷8周后，采用BBB評分、斜板實驗

6、和BDA染色評估神經功能恢復情況;
　　3.在損傷8周后，通過HE染色和MRI檢測不同干預條件下脊髓空洞體積;
　　4.在損傷2周后，采用免疫組織化學染色觀察了膠質瘢痕細胞內外成分膠原纖維酸性蛋白(GFAP)和硫酸軟骨蛋白多糖(CSPG)表達情況。
　　結果:
　　1.姜黃素處理組中BBB評分、斜板實驗和BDA染色均優(yōu)于對照組，并且隨著濃度增加效果增強，姜黃素300mg/kg實驗組效率最好;
　　2.姜黃素

7、能顯著抑制脊髓損傷8周后膠質瘢痕形成;
　　3.姜黃素能抑制膠質瘢痕細胞內GFAP和細胞外CSPG成分;
　　4.姜黃素能抑制膠質瘢痕中炎癥因子表達。
　　結論:
　　姜黃素能促進脊髓損傷后大鼠神經功能恢復。姜黃素通過抗炎作用抑制膠質瘢痕細胞內成分GFAP表達。姜黃素通過抑制轉錄因子減少膠質瘢痕細胞外成分CSPG表達。聯合抑制細胞內外成分是姜黃素發(fā)揮抑制膠質瘢痕形成的作用機制。
　　二.姜黃素對星形膠質細胞

8、的作用及機制
　　目的:
　　通過在體和離體實驗，探討姜黃素干預下星形膠質細胞在炎癥反應與纖維化過程中表型的轉變以及其與膠質瘢痕細胞內外成分GFAP和CSPG表達的相互關系。
　　方法:
　　1.使用SD大鼠建立脊髓損傷模型并給予300 mg/kg姜黃素連續(xù)干預7天，采用姜黃素溶劑DMSO作為對照;
　　2.通過體外培養(yǎng)原代星形膠質細胞，并使用siRNA干擾NF-κb亞基p65和SOX9基因，采用EMSA、

9、WB和PCR檢測干擾效率;
　　3.使用免疫熒光、WB和PCR檢測膠質瘢痕細胞內成分GFAP表達和NF-κb信號通路的相互關系，ELISA檢測星形膠質細胞中趨化因子表達情況，流式細胞技術檢測膠質瘢痕中T淋巴細胞和巨噬細胞的數量。
　　結果:
　　1.姜黃素能抑制NF-κb信號通路成分p-IKK-α、p-IKK-β、p-IκB-α和p65表達，上調NF-κb抑制性分子IκB-α表達，從而抑制星形膠質細胞活化;
　　

10、2.姜黃素能通過調控NF-κb信號通路抑制星形膠質細胞釋放趨化因子MCP-1、RANTES和CXCL10，
　　3.姜黃素能通過調控NF-κb信號通路減少膠質瘢痕中T淋巴細胞和巨噬細胞浸潤。
　　結論:
　　姜黃素通過干預NF-κb信號通路抑制星形膠質細胞的活性，抑制其分泌趨化因子，從而減少膠質瘢痕中巨噬細胞和T淋巴細胞浸潤，減輕星形膠質細胞介導的炎癥反應。姜黃素通過調控SOX9信號通路抑制星形膠質細胞纖維化，減少細胞

11、外基質成分CSPG沉積。姜黃素能通過聯合發(fā)揮抗炎抗纖維化作用，有效抑制脊髓損傷后膠質瘢痕細胞內外成分，有利于脊髓損傷后神經功能恢復。
　　三.姜黃素對小膠質細胞的作用及機制
　　目的:
　　本研究使用核因子E2-轉錄相關因子-2(Nrf2)基因敲除小鼠Nrf2(-/-)和野生型小鼠Nrf2(+/+)，建立脊髓損傷模型或LPS誘導原代小膠質細胞，并給予不同濃度姜黃素干預后，探討了姜黃素在脊髓損傷后小膠質細胞活化中的作用及

12、其機制。
　　方法:
　　1.使用Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠，建立脊髓損傷模型，給予不同濃度姜黃素(100mg/kg，50mg/kg，25mg/kg)連續(xù)干預7天;
　　2.采用WB檢測脊髓損傷后28天內小膠質細胞活性與Nrf2表達之間的關系;
　　3.體外培養(yǎng)原代小膠質細胞，LPS刺激后給予姜黃素或ERK抑制劑U0126干預。
　　結果:
　　1.脊髓損傷后Nrf2和iNOS表達即可

13、升高，并于傷后第7天時達到峰值;
　　2.在體實驗發(fā)現姜黃素干預后能促使小膠質細胞中Nrf2由胞漿轉運到胞核中，抑制iNOS表達，抑制小膠質細胞活性，且存在濃度依賴性，Nrf2基因敲除后廢除了姜黃素對小膠質細胞的抑制作用;
　　3.離體實驗顯示，姜黃素干預Nrf2(+/+)小膠質細胞后，p-ERK和iNOS表達均下降，而Nrf2(-/-)小膠質細胞中p-ERK表達沒有改變。
　　結論:
　　姜黃素抑制脊髓損傷后小

14、膠質細胞的活性，通過減輕小膠質細胞介導的炎癥反應發(fā)揮神經保護作用。姜黃素抑制小膠質細胞激活是通過調控Nrf2/ERK/p65通路實現的。
　　四.控制炎癥反應后對神經干細胞再生的影響及機制
　　目的:
　　神經干細胞(neural stem/progenitor cells，NSPCs)具有自我增值及分化為中樞神經系統(tǒng)神經細胞的潛能，是神經損傷后細胞替代療法的重要細胞來源。如何誘導NSPCs定向分化為神經元和少突膠質細

15、胞，是神經科學領域研究的重點和難點，也是熱點之一。本研究中我們通過體外培養(yǎng)小膠質細胞并誘導其分化為M1型和M2型，而后觀察各細胞上清誘導NSPCs分化情況，闡述不同表型的小膠質細胞在NSPCs分化中的作用及其機制。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)小膠質細胞，給予不同干預誘導小膠質細胞表型轉變，采用免疫熒光、WB和PCR檢測M1和M2型小膠質細胞標記物表達情況;
　　2.收集不同表型小膠質細胞上清制成NSPCs誘導分化培養(yǎng)

16、基并誘導NSPCs分化，采用免疫熒光和WB檢測神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞分化比例;
　　3.采用液相色譜一質譜分析和ELISA實驗檢測M2型小膠質細胞PPARγ和15d-PGJ2表達情況。
　　結果:
　　1.LPS+IFN-γ誘導小膠質細胞表型轉變?yōu)镸1型，IL-4誘導小膠質細胞表型轉變?yōu)镸2型;
　　2.M2型小膠質細胞上清誘導NSPCs分化為神經元和少突膠質細胞的比例升高，分化為星形膠質細胞的比例減

17、少;
　　3.M2型小膠質細胞中PPARγ和15d-PGJ2表達與M0和M1型相比較顯著升高。
　　結論:
　　M2型小膠質細胞可以增加NSPCs分化為神經元和少突膠質細胞的比例，減少星形膠質細胞分化數量。M2型小膠質細胞促進NSPCs分化是通過激活PPARγ/β-catenin信號通路實現的。
　　綜上結果表明，姜黃素能抑制星形膠質細胞和小膠質細胞介導的炎癥反應，同時還能抑制星形膠質細胞纖維化。姜黃素通過聯合發(fā)