三種激發(fā)子誘導的過敏性細胞死亡和氣孔關閉的分子機制研究.pdf

1、植物病原菌產生的激發(fā)子和病程相關分子模式(pathogen-associated molecularpatterns，PAMP)是一類重要的信號分子，模仿非親和互作中植物與病原菌的信號交流，啟動不同的級聯(lián)信號途徑，誘發(fā)植物的抗病性，導致過敏反應(hypersensitive response，HR）和氣孔關閉。本研究采用病毒誘導基因沉默(virus inducing gene silencing，VIGS)技術研究了本氏煙(Nicoti

2、ana benthamiana)NADPH氧化酶(respiratory burst oxidasehomologues，RBOH)、液泡加工酶(vacuolar processing enzyme，VPE)、異三聚體G蛋白（簡稱G蛋白）及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)在不同來源的激發(fā)子(harpin、Nepl和boehmerin)誘發(fā)的過敏反應和氣孔關閉中的功能，這些激

3、發(fā)子分別是細菌(Xanthomonas oryzae)、真菌(Magnaporthe oryzae)和卵菌(Phytophthoraboehmeriae)的PAMPs。試驗證明RBOH、VPE和G蛋白參與3種激發(fā)子誘導的氣孔關閉，MAPKKKa-MEK2-WIPK介導激發(fā)子Nepl誘發(fā)的HR，而Gα、Gβ2和VPEla參與harpin謗導的HR，表明不同激發(fā)子誘發(fā)的信號傳導途徑具有一定保守性，同時不同的激發(fā)子誘導的信號傳導也存在特異性。

4、
　　 RBOH是最重要的活性氧(active oxygen species，AOS)來源之一.NbrbohA、NbrbohB單基因沉默，以及NbrbohA和NbrbohB雙基因沉默顯著抑制了boehmerin、INF1和harpin等3種激發(fā)子誘發(fā)的葉片中H202積累，但不影響激發(fā)子誘導的HR，且基因沉默對激發(fā)子誘發(fā)的PR基因的轉錄沒有影響；而這些基因沉默卻抑制激發(fā)子誘導的氣孔關閉，且保衛(wèi)細胞內NO積累顯著減少，但不影響保衛(wèi)細

5、胞內Ca2+濃度和AOS積累.說明RBOH參與激發(fā)子誘導的氣孔關閉，但不參與激發(fā)子誘導的過敏反應和PR基因的轉錄；植物體內其它酶催化產生的AOS及AOS/NO平衡可能參與激發(fā)子誘發(fā)的過敏性細胞死亡.
　　 VPE是植物液泡的半胱氨酸蛋白酶，具有類似動物caspases-l-like酶活性，本試驗發(fā)現(xiàn)NbVPEla和NbVPElb單基因沉默，及NbVPEla/1b雙基因沉默不影響harpin、boehrnerin和Nepl激發(fā)子誘

6、發(fā)的H202積累，NbVPEIa和NbVPEla/16沉默卻抑制了harpin誘發(fā)的HR;而boehmerin和Nepl均可誘發(fā)這3種VPE沉默的植株產生正常的HR，表明harpin誘發(fā)的HR依賴于VPE，但是VPE不參與boehmerin和Nepl誘發(fā)的HR。單基因和雙基因沉默均抑制3種激發(fā)子誘發(fā)的氣孔關閉，且抑制了保衛(wèi)細胞內NO的積累；3種激發(fā)子誘導處理后，單基因沉默植株葉片中保衛(wèi)細胞內活性氧的積累與對照一致，但是雙基因沉默植株中保

7、衛(wèi)細胞內AOS的量顯著高于對照和單基因沉默植株中保衛(wèi)細胞內AOS的量，表明雙基因共同作用負調控保衛(wèi)細胞內AOS的積累。進一步轉錄分析顯示VPE調節(jié)了活性氧相關的基因(NbrbohB)和轉錄因子(WRKY2)的轉錄。而已證明氣孔在植物免疫中具有重要功能，提示VPE參與PAMP觸發(fā)的抗性(PAMP-triggeredimmunity，PTI)。
　　 G蛋白連接著細胞表面的受體和下游的效應因子，在植物多種信號途徑中具有重要的作用。本

8、研究克隆了N.benthamiana G蛋白Gα,Gβ1和Gβ2等基因及腺苷酸環(huán)化酶基因(adenylyl cyclase，Ac)，Gα和Gβ2沉默抑制細菌蛋白激發(fā)子harpir誘導的過敏反應；Gα、Gβ2、AC削弱了3種激發(fā)子誘發(fā)的H202積累。Gα，Gβ1、Gβ2沉默抑制激發(fā)子誘發(fā)的氣孔關閉，且保衛(wèi)細胞中N0的積累減少。但是AC基因沉默對3種激發(fā)子誘發(fā)過敏反應和氣孔關閉及保衛(wèi)細胞內NO的積累均沒有影響。結果表明G蛋白的Gα、Gβ亞基

9、在不同激發(fā)子激發(fā)過敏反應和氣孔關閉及N0和H202積累中作用存在差異。
　　 MAPK信號級聯(lián)途徑包含三個保守的激酶，MAPK kinase Kinase(MAPKKK或MEKK)磷酸化MAPK kinase(MAPKK或MEK)又磷酸化MAPK，調節(jié)荷爾蒙和其它環(huán)境刺激或外源信號。MAPKKKα、MEK2和WIPK沉默煙草抑制了Nepl誘導的HR;MEK1、SIPK和NTF6沉默的本氏煙不影響harpin、Nepl和boehm

10、erin誘導的HR。Nepl處理的基因沉默植株內，轉錄因子(WRKY2)和防衛(wèi)基因(PR2b)的表達受抑制。WRKY2沉默后也抑制了Nepl誘導的HR，但不影響boehmerin和harpin誘導的HR。另外，MEK2-NTF6調節(jié)激發(fā)子誘導的H202積累；MEK2-WIPK調節(jié)Nepl誘導的NO積累，SIPK沉默削弱了激發(fā)子誘導的保衛(wèi)細胞內NO積累?；虺聊瑹煵莶挥绊懠ぐl(fā)子誘導的保衛(wèi)細胞內Ca2+濃度和AOS積累。結果表明，MAPKK