人支氣管上皮細胞和嗜中性粒細胞接觸共培養(yǎng)誘導炎性細胞因子合成及葛根素的抑制作用.pdf

1、目的：⑴構建支氣管上皮細胞(BEAS-2B細胞)和嗜中性粒細胞(Neutrophils細胞)接觸共培養(yǎng)體系。⑵給予共培養(yǎng)體系不同劑量葛根素進行干預,探討其對炎性細胞因子的影響。⑶探討不同劑量葛根素對共培養(yǎng)體系NF-κB、p38MAPK信號轉導通路的影響。
　　 方法：①采用免疫磁珠法分離純化人外周血Neutrophils細胞,與BEAS-2B細胞接觸培養(yǎng)構建共培養(yǎng)體系。②隨機分為6個實驗組:BEAS-2B單獨培養(yǎng)組(BEAS-2

2、B組),Neutrophils細胞(Neutrophils組),BEAS-2B細胞和Neutrophils細胞接觸共培養(yǎng)～(BEAS-2B+Neutrophils組),50μg/ml葛根素干預BEAS-2B細胞和Neutrophils細胞共培養(yǎng)組(BEAS-2B+Neutrophils+PUE50組),100μg/ml葛根素干預BEAS-2B細胞和Neutrophils細胞共培養(yǎng)組(BEAS-2B+Neutrophils+PUE100組

3、),200μg/ml葛根素干預BEAS-2B細胞和共培養(yǎng)組(BEAS-2B+Neutrophils+PUE200組)。③應用蛋白芯片篩查BEAS-2B細胞和Neutrophils細胞單獨培養(yǎng)、聯合培養(yǎng)、加葛根素干預培養(yǎng)體系12h后細胞因子表達差異；應用ELISA方法定量測定上述不同培養(yǎng)體系于培養(yǎng)第2h、6h、12h、18h炎性細胞因子濃度；應用Real-time PCR方法檢測上述不同培養(yǎng)體系培養(yǎng)12h后BEAS-2B細胞和Neutro

4、phils細胞中炎性細胞因子基因表達；應用Western blot方法對上述不同培養(yǎng)體系培養(yǎng)單獨或接觸共培養(yǎng)30min后BEAS-2B細胞和Neutrophils細胞中的Phospho-IκBα、IκB-α、Phospho—p38、p38蛋白的表達情況進行分析。
　　 結果：⑴BEAS-2B組及Neutrophils組在單獨培養(yǎng)條件下,有少量的IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、TIMP-2分泌；BEAS

5、-2B細胞和Neutrophils細胞聯合培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、TIMP-2濃度升高。BEAS-2B+Neutrophils組與BEAS-2B組和Neutrophils組之和相比較,IL-6、IL-8、MCP-1、MIP—1α、MIP-1β、TIMP-2濃度明顯增加(p<0.05)。給予不同濃度葛根素對聯合培養(yǎng)的BEAS-2B細胞和Neutrophils細胞進行干預后,BEAS-2B+N

6、eutrophils+PUE50組、BEAS-2B+Neutrophils+PUE100組、BEAS-2B+Neutrophils+PUE200組分泌的IL-6、IL-8、MCP-1、MIP—1α、MIP-1β、TIMP-2濃度有不同程度下降(與BEAS-2B+Neutrophils組比較,p<均<0.01)。⑵聯合培養(yǎng)后BEAS-2B細胞中IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、TIMP-2基因表達水平明顯上調,而

7、經葛根素干預可顯著抑制兩種細胞聯合培養(yǎng)上述炎性細胞因子基因表達。⑶于Neutrophils共培養(yǎng)的BEAS-2B細胞較單獨培養(yǎng)的BEAS-2B細胞,其Phospho-IκB和Phospho-p38蛋白表達明顯增加,差異有統計學意義(p<0.001)。對共培養(yǎng)體系應用不同濃度的葛根素進行干預,BEAS-2B細胞與共培養(yǎng)體系中未經葛根素干預的BEAS-2B細胞相比,Phospho-IκB和Phospho-p38蛋白表達明顯降低,差異有統計學

8、意義(p<0.01)。應用葛根素干預的共培養(yǎng)體系中的Neutrophils細胞較未經葛根素干預的Neutrophils細胞Phospho-IκB和Phospho-p38蛋白表達明顯降低(p<0.01)。
　　 結論：①Neutrophils細胞與BEAS-2B細胞聯合培養(yǎng)可上調BEAS-2B細胞中IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、TIMP-2基因表達和顯著增加細胞培養(yǎng)上清液中上述炎性細胞因子濃度；②葛根