雷公藤紅素對破骨細胞及膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠中趨化因子CXCL2表達的影響.pdf

1、實驗?zāi)康?
　　探討雷公藤紅素(Celastrol，Cel)對小鼠骨髓誘導(dǎo)破骨細胞分化及膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠(CIA)模型局部關(guān)節(jié)炎癥及骨侵蝕的影響，以及Cel對破骨細胞分化過程中及CIA小鼠中趨化因子CXCL2表達的作用。
　　實驗方法:
　　1.細胞實驗
　　采用骨髓誘導(dǎo)破骨細胞的方法培養(yǎng)破骨細胞，檢測破骨細胞中趨化因子的表達及Cel對破骨細胞中CXCL2表達的影響。實驗包括:1.取小鼠骨髓細胞，加入MCSF

2、及RANKL細胞因子誘導(dǎo)形成破骨細胞;2.通過CCK8法測定Cel對骨髓細胞活性的影響，確定不影響細胞活性的安全濃度范圍;3.通過抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色觀察Cel對破骨細胞的影響;4.熒光實時定量PCR(Real-time PCR)檢測相關(guān)趨化因子，如CXCL2、CXCL9、CXCL11的相對表達量及Cel對趨化因子表達的影響。
　　2.動物實驗
　　建立膠原CIA小鼠模型，檢測Cel對CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥的作用并

3、探討相關(guān)趨化因子與骨侵蝕的相關(guān)性。實驗包括:1.建立CIA模型，觀察小鼠體征并記錄小鼠的體重變化;2.根據(jù)小鼠關(guān)節(jié)炎評分標準進行評分;3.通過HE染色等病理學方法觀察Cel對CIA小鼠關(guān)節(jié)的炎癥及骨侵蝕的作用;4.通過小鼠關(guān)節(jié)Micro-CT三維重建及關(guān)節(jié)中TRAP的表達，直觀觀察Cel對CIA小鼠關(guān)節(jié)破壞及體內(nèi)破骨細胞分化及功能的影響;5.通過ELISA方法檢測Cel對CIA小鼠血清中CXCL2的影響;6.通過熒光實時定量PCR(Re

4、al-time PCR)檢測Cel對CIA小鼠關(guān)節(jié)CXCL2及其受體的表達影響。
　　實驗結(jié)果:
　　1.細胞實驗:
　　通過CCK8法測定結(jié)果顯示，Cel濃度為1μ M、2μ M，5μ M時，明顯影響小鼠骨髓細胞的活性，而Cel濃度為0.1μ M、0.25μ M及0.5μ M時，對細胞活性無明顯影響，因此選用0.1μ M、0.25μ M、0.5μ M三個濃度進行實驗;通過抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色觀察其細胞胞

5、體大、形態(tài)不規(guī)則、酶活性部分（胞質(zhì)）呈轉(zhuǎn)紅色、多核（大于等于3核）的巨噬細胞為破骨細胞，Cel對破骨細胞的形成有明顯抑制作用，且成濃度依賴性;熒光實時定量PCR檢測結(jié)果顯示:CXCL2在破骨細胞中表達升高，Cel能夠明顯抑制破骨細胞形成過程中CXCL2的表達，且在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性。
　　2.動物實驗:
　　根據(jù)關(guān)節(jié)炎評分標準，Cel組關(guān)節(jié)炎評分較膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎組降低明顯(P＜0.01)，提示Cel能夠明顯抑制CIA

6、小鼠關(guān)節(jié)的腫脹;HE染色結(jié)果顯示，Cel能明顯減少關(guān)節(jié)周圍炎性細胞浸潤及關(guān)節(jié)破壞;Micro-CT及關(guān)節(jié)TRAP染色結(jié)果顯示，Cel能夠有效抑制CIA小鼠關(guān)節(jié)中破骨細胞的數(shù)量和骨侵蝕程度。ELISA實驗結(jié)果顯示，CIA組小鼠血清中CXCL2表達相對于空白對照組升高，Cel能顯著抑制膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠血清中CXCL2的表達(P=0.0003)。熒光實時定量PCR結(jié)果顯示，CIA組小鼠關(guān)節(jié)中CXCL2及CXCR2的表達均升高，其中CXCL2

7、的表達升高更為明顯(P＜0.0161)，Cel能顯著抑制關(guān)節(jié)中CXCL2及其受體的表達。
　　結(jié)論:
　　1.趨化因子CXCL2在破骨細胞形成的過程中高表達，提示CXCL2可能在破骨形成的階段發(fā)揮作用;2.Cel能夠抑制小鼠骨髓細胞誘導(dǎo)破骨細胞的形成及分化;3.趨化因子CXCL2在CIA小鼠中高表達，可能參與了骨侵蝕的過程;4.Cel能夠抑制CIA小鼠關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)及骨侵蝕;5.Cel可能通過下調(diào)趨化因子CXCL2及其受體的