nanog和CD73在心成纖維細胞向心肌分化中的作用機制.pdf

1、成纖維細胞分布廣泛，對機體組織結構和功能的維持十分重要。傳統(tǒng)觀念認為，成纖維細胞是一種均一的細胞群，在不同的器官組織中，發(fā)揮其支持和分泌功能。近期研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞是多種成纖維細胞亞群的總稱，在細胞形態(tài)、生長增殖、膠原合成、分泌細胞因子和表面受體表達等方面具有顯著異質性。由于近年來發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞具有間充質干細胞樣特性，表現(xiàn)出多向分化的潛能，故已成為生命科學研究的熱點。但不同器官的成纖維細胞是否存在分子標記的表達差異，以及它們在分化潛

2、能方面是否存在異質性等，目前尚缺少比較性研究。心肌細胞的增殖能力較低，一旦心肌細胞受到損傷，低效率的心肌細胞增殖很難滿足心肌修復的需要。而心臟成纖維細胞數(shù)量巨大，占心臟細胞總數(shù)高達60％，抗缺氧損傷能力強，具有較高的增殖和代謝活性。如果能將具有增殖和分化潛能的心肌成纖維轉化為心肌細胞，不但可以減少對心臟的不利影響，而且可高效增加心肌細胞數(shù)量，改善心功能。但如下問題需要闡明：心肌成纖維細胞是否表達多種干細胞的標記物，具備干細胞的生物特性；

3、不同心肌成纖維細胞亞群的心肌分化差異如何？是否存在心肌分化優(yōu)勢亞群；心肌化優(yōu)勢亞群在體外培養(yǎng)和體內損傷心肌修復中的療效評價如何；成纖維細胞在心肌分化中關鍵基因及其相互調控的分子機制如何？本研究評價新生大鼠心、肺、脾、腎、肝和皮膚的成纖維細胞的形態(tài)學特點、表面標記、多向分化潛能等方面差異；探討心臟成纖維細胞（CFs）心肌化不同時段nanog、sox2和c-Myc等相關基因表達的時程順序；分選出CFs不同亞群，比較不同亞群向心肌分化差異，抑

4、制、敲除或過表達心肌分化及干細胞相關基因CD73和nanog，檢測sca-1、c-kit、sox2和c-myc的表達差異，證實CD73和nanog是CFs向心肌分化的關鍵基因及其相互作用，并驗證CFs不同亞群及關鍵基因在心肌梗死動物模型中的生物學行為及其對心肌損傷的治療作用。本研究主要內容包括：
　?、挪煌鞴俪衫w維細胞的體外分離培養(yǎng)和鑒定存在異質性。為了證明不同器官成纖維細胞的生物學表型差別，篩選出心肌分化的優(yōu)勢細胞群，利用酶聯(lián)

5、合消化法對心、肝、脾、肺、腎和皮膚成纖維細胞進行體外分離培養(yǎng)和比較。此方法分離培養(yǎng)的細胞活力好、純度高、收獲細胞量大。但不同器官成纖維細胞存在明顯的異質性，主要表現(xiàn)為：酶消化時間不同。心、肺、肝、脾、腎和皮膚組織塊（1mm3）的酶作用時間分別為40 min、30 min、25 min、20 min、35 min和80 min；細胞形態(tài)有差別。多器官成纖維細胞在細胞形狀和胞體大小上略有差別；生長速率不同。依據(jù)測定的生長曲線，肺成纖維細胞增

6、殖速率最快，依次是皮膚、肝、腎、脾和心成纖維細胞。常見成纖維細胞標記表達不同。DDR2在肺和腎的成纖維細胞中不表達，皮、肝和脾中僅有部分成纖維細胞表達，在心成纖維細胞中呈強表達，因此，DDR2可作為心成纖維細胞的有效標記蛋白。而vimentin和FSP1聯(lián)合鑒定可作為皮、肝、腎、脾和肺成纖維細胞有效分子標記。
　　⑵不同器官成纖維細胞存在間充質干細胞表型的異質性。細胞水平和組織水平分別檢測不同器官成纖維細胞表達干細胞標記差異，并鑒

7、定其在成脂、成骨、成神經(jīng)和成心肌定向分化潛能方面存在的差異。組織水平上心、皮膚和肝成纖維細胞表達nanog較高，肝、腎和皮成纖維細胞表達c-kit較多，而肝、皮和脾中sca-1+成纖維細胞含量較多；細胞水平上顯示，六種器官中部分成纖維細胞表達nanog、c-kit和sca-1，但陽性率高于組織水平；CD90流式分選六種器官成纖維細胞陽性率顯示，皮成纖維細胞為76.5%，心為34.9%，肺為13.8%，腎為6.8%，肝為0.8%，脾僅為0

8、.2%；體外多向分化誘導顯示，皮膚成纖維細胞表現(xiàn)出較強的多向誘導分化潛能，心成纖維細胞次之，肝和腎成纖維細胞在向心肌分化中也具有優(yōu)勢，脾成纖維細胞在成骨方面具有優(yōu)勢外，其余均最低。提示心成纖維細胞在向心肌分化中并非是最優(yōu)器官。
　?、荂Fs干細胞標記表達的生物表型多樣性。細胞免疫熒光三標技術檢測部分CFs中nanog分別和CD73、CD90和sca-1，及其CD90和sca-1存在共表達，且nanog+/CD73+共表達陽性率最高

9、（59.02+8.39%），與其它三組相比均有極顯著差異（P<0.01）；而 nanog+/CD90+共表達CFs陽性率與nanog+/sca-1+之間沒有顯著差異（P>0.05），但這兩組與CD90+/sca-1+相比均有極顯著差異（P<0.01）；CD90+/sca-1+共表達CFs陽性率均低于其它三組，差異具有極顯著意義（P<0.01）。說明CFs存在干細胞的優(yōu)勢亞群，在表型上存在多樣性。
　?、菴Fs心肌化誘導不同時間點各

10、相關基因表達差異。5-aza誘導CFs后5d、7d、14d、21d和28d，細胞形態(tài)和生長速率不同；nanog和sox2伴隨著心肌化進程呈現(xiàn)表達下降趨勢，而CD73、cMyc、klf4、Mef2c和cTnT則呈現(xiàn)出表達逐步增加，CD90在五個時間點內變化不大，但整體表達水平較高，而c-kit在14d時略微下降，整體表達水平較低。cTnT表達在心肌化誘導28d最為穩(wěn)定，5d少量細胞表達，7d～14d cTnT陽性細胞數(shù)明顯增高，28d表達

11、趨于穩(wěn)定，繼續(xù)誘導培養(yǎng)至35d和至40d，cTnT陽性細胞數(shù)量未見明顯改變。④CFs心肌化誘導28d亞微結構觀察顯示，細胞與細胞間出現(xiàn)端-端連接，但特化連接不典型。細胞質內出現(xiàn)大量的肌原纖維，排列較為規(guī)律，但肌節(jié)不明顯，H帶、Z線和M線顯示不清。
　　⑸CD90+CFs為心肌樣細胞分化優(yōu)勢亞群。使用PE-標記CD90、PE-標記陰性對照，不加抗體的為空白對照。流式細胞儀檢測分選CFs，其陽性比率為34.9%。體外擴大培養(yǎng)后，細胞免

12、疫熒光檢測其表型穩(wěn)定；心肌化誘導CD90+亞群，28d時，cTnT陽性細胞比率為61.17+9.75%，混合群cTnT陽性細胞比率為53.44+16.80%，表明CD90+細胞群體外培養(yǎng)條件下更有利于向心肌細胞分化；DAPI標記CD90+CFs細胞核，移植入急性心肌梗死動物模型梗死區(qū)和梗死邊緣區(qū)，追蹤移植細胞在模型動物體內的存活及其向心肌樣細胞的分化能力。超聲心動檢測，在CD90+CFs移植組中，與細胞移植前相比，移植后1周和2周左室射

13、血分數(shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)均升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，移植后2周較移植后1周也顯著提高，差異具有極顯著意義(LVEF：61.40+2.45%vs56.25+2.93%，LVFS：33.21+0.68%vs30.26+2.06%，P<0.01)。與CFs移植組相比，CD90+CFs移植組在移植后1周和2周，LVEF有所升高，LVFS略微下降，但差異無統(tǒng)計學意義（LVEF：61.40+2.45%vs60.

14、10+1.25%，LVFS：33.21+0.68%vs33.85+2.00%，P>0.05）。病理組織切片證實在體內微環(huán)境作用下，僅有少部分CD90+CFs向心肌樣細胞轉化和參與新生血管的生成。
　?、事《痉纸M轉染目的基因，確定心肌分化關鍵基因，探討關鍵基因之間的調控機制。為探討決定心肌分化的關鍵基因，構建nanog抑制、CD73抑制和過表達慢病毒載體，分別或共轉染CFs，實驗分組為nanog抑制表達轉染組、CD73抑制表達轉染

15、組、CD73過表達轉染組、nanog抑制和CD73抑制共轉染組、nanog抑制和CD73過表達共轉染組，同時設立空載體轉染組作為對照。采用滴度稀釋法，確定各實驗組MOI。nanog抑制表達轉染組MOI值為40，CD73抑制表達轉染組為50，CD73過表達慢病毒轉染組為40。nanog顯著影響細胞增殖，CD73對其影響不大。各組慢病毒轉染陽性率>85%，視為轉染成功。轉染后180 hrs觀察各組轉染效率和細胞增殖速率。發(fā)現(xiàn)nanog抑制的

16、陽性細胞增殖緩慢，由轉染時陽性率為92%降低至35%；但在CD73抑制組和CD73過表達組中，陽性細胞的增殖則不受影響，陽性率仍然達到85%以上；在共轉染組中，nanog抑制的陽性細胞較CD73過表達或抑制的生長速率稍慢，但共轉染陽性率較為穩(wěn)定。nanog抑制或者CD73過表達，或兩者的協(xié)同作用，更有利于CFs向心肌樣細胞分化。nanog抑制和CD73過表達共轉染組呈現(xiàn)出較強的心肌細胞分化優(yōu)勢，cTnT和cMyc基因表達水平較高，而na

17、nog和sox2表達下降；其次是CD73過表達轉染組，呈現(xiàn)出CD73基因的過表達，表現(xiàn)為cTnT的高表達；CD73抑制后，cTnT表達下降，而nanog、sox2表達反而上升。RTCA Cardio ECR系統(tǒng)實時檢測心肌化誘導各慢病毒轉染組細胞生長曲線不同，未檢測到其律動與場電位。心肌化的CD73過表達組、未誘導的nanog抑制和CD73過表達共轉染組、未誘導的nanog抑制和CD73抑制共轉染組和未誘導的nanog抑制組細胞增殖能力

18、較強；心肌化的nanog抑制組、心肌化的nanog抑制和CD73過表達共轉染組和心肌化的未轉染組其次；而心肌化的nanog抑制和CD73抑制共轉染組增殖能力最弱。但在不同時間點均未檢測到不同處理的各個慢病毒轉染組細胞的跳動和胞外電活動。
　　⑺研究表明：不同器官成纖維細胞在生長方式、形態(tài)特點、間充質干細胞標記表達等存在明顯的異質性，但CFs并非心肌分化最優(yōu)種子細胞；CFs是由不同亞群組成的、具有干細胞特征混合細胞群，根據(jù)其干細胞標