Siglec-1介導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病中的研究.pdf

1、研究背景：動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是缺血性心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)，其發(fā)病機(jī)制至今尚未闡明。近年來(lái)認(rèn)為免疫炎癥特別是由巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的天然免疫在A(yíng)S的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Siglec-1（sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin1，唾液酸黏附素，又名CD169）作為單核巨噬細(xì)胞激活的重要標(biāo)志，在SLE、系統(tǒng)性硬化、HIV 感染等自身免疫性疾病和炎癥性疾病外周血

2、及病變組織表達(dá)增高，并參與分泌細(xì)胞因子和激活T淋巴細(xì)胞等過(guò)程。但其在冠心病發(fā)病過(guò)程中的作用還不清楚。
　　 目的：本研究擬通過(guò)外周血分析、體外細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)三個(gè)層次，研究siglec-1在冠心病患者中的表達(dá)及其在A(yíng)S 發(fā)病過(guò)程中的作用，探討siglec-1作為評(píng)價(jià)疾病活動(dòng)性的指標(biāo)或作為潛在治療靶點(diǎn)的價(jià)值。
　　 方法：
　　 （1外周血表型分析a) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)冠心病病人和正常對(duì)照組外周血單核細(xì)胞CD1

3、4CD169 雙陽(yáng)性細(xì)胞比例。
　　 B)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，抽提總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA, 實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量PCR 檢測(cè)siglec-1mRNA表達(dá)情況。
　　 C) 根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果，計(jì)算冠心病病人冠狀動(dòng)脈狹窄程度評(píng)分Gensini Score，并與siglec-1表達(dá)作相關(guān)性分析。
　　 D) 檢測(cè)冠心病危險(xiǎn)因子超敏C 反應(yīng)蛋白（hs-CRP）和同型半胱氨酸(HCY)，并與siglec-1表達(dá)作相關(guān)性

4、分析。
　　 （2 體外細(xì)胞培養(yǎng)a) 體外培養(yǎng)RAW264.7 巨噬細(xì)胞株及原代小鼠骨髓巨噬細(xì)胞。
　　 B) 各種刺激劑如ox-LDL、M-CSF、INF-α等刺激巨噬細(xì)胞siglec-1高表達(dá)；小干擾RNA 或抗體阻斷技術(shù)抑制siglec-1表達(dá)。
　　 C) 觀(guān)察各組巨噬細(xì)胞分泌趨化因子MCP-1、MIP-1alpha、MIP-2和吞噬ox-LDL的能力。
　　 D) 磁珠分選外周血CD4+、CD8

5、+、CD14+細(xì)胞，單核細(xì)胞（CD14+）和淋巴細(xì)胞（CD4+、CD8+）混合培養(yǎng)觀(guān)察單核細(xì)胞siglec-1抑制和表達(dá)增強(qiáng)后刺激CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞因子的變化。
　　 （3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)a) 高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。
　　 B)構(gòu)建帶siglec-1小干擾序列的慢病毒載體和對(duì)照病毒載體，尾靜脈注射小鼠，靶向敲除siglec-1后再高脂喂養(yǎng)4個(gè)月，觀(guān)察小鼠粥樣斑塊形成。
　

6、　 C)免疫組化觀(guān)察粥樣斑塊中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞數(shù)量。
　　 D) 熒光定量PCR 檢測(cè)主動(dòng)脈IL-1、TNF-α炎性細(xì)胞因子分泌情況。
　　 結(jié)果：
　　 （1外周血表型分析a) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Siglec-1在正常對(duì)照組及冠心病組淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞上均無(wú)表達(dá)；冠心病組單核細(xì)胞CD14CD169 雙陽(yáng)性率為 (11.53.9)％，顯著高于健康對(duì)照組的陽(yáng)性率[(1.82.0)％，P

7、<0.01]。
　　 B) 冠心病組Siglec-1mRNA的平均拷貝數(shù)顯著高于健康對(duì)照組，為健康對(duì)照組的3.17倍；而冠心病血脂正常組和血脂異常組的Siglec-1陽(yáng)性率和mRNA平均拷貝數(shù)均無(wú)明顯差異。
　　 C) 冠心病患者siglec-1mRNA表達(dá)和冠心病嚴(yán)重程度評(píng)分Gensini Score及炎癥活動(dòng)指標(biāo)hs-CRP、HCY 三者成正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r和p值分別為：r=0.338, P=0.015; r=0.3

8、16,P=0.016; r=0.224, P=0.042)。
　　 （2 體外細(xì)胞培養(yǎng)a) 各種刺激劑如ox-LDL、M-CSF、INF-α等能有效刺激巨噬細(xì)胞siglec-1高表達(dá)；
　　 小干擾RNA 或抗體阻斷能特異性抑制siglec-1表達(dá)。
　　 B) siglec-1高表達(dá)后可以明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞MCP-1、MIP-1alpha及MIP-2的分泌和吞噬ox-LDL，而siglec-1表達(dá)降低后上述作用逆

9、轉(zhuǎn)。
　　 C) 冠心病患者外周血CD14+單核細(xì)胞比正常人單核細(xì)胞具有更強(qiáng)的刺激T細(xì)胞增殖和促炎性細(xì)胞因子分泌的作用。當(dāng)用INF-α上調(diào)正常人單核細(xì)胞siglec-1表達(dá)后，單核細(xì)胞刺激CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，刺激CD4+T細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子（IL-2、IL-12、INF-γ）分泌能力增強(qiáng)，抗炎性細(xì)胞因子（IL-10）分泌減弱，并且這種作用可通過(guò)siRNA 或抗siglec-1單抗靶向阻斷而逆轉(zhuǎn)。
　　

10、（3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)a)小干擾siglec-1組比對(duì)照病毒組動(dòng)脈粥樣斑塊形成緩慢，斑塊面積占動(dòng)脈總面積分別為(14.043±1.342)％和 (33.487±2.715)％，p<0.001。
　　 B)小干擾siglec-1組比對(duì)照病毒組粥樣斑塊中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量少；IL-1、TNF-α炎性細(xì)胞因子分泌能力低（分別為0.2646±0.0387vs. 1.0032±0.0969, p<0.001和0.18

11、20±0.0193vs. 1.0119±0.1964, p<0.01)。
　　 結(jié)論：siglec-1作為一種反映冠心病嚴(yán)重程度和炎癥活動(dòng)性的無(wú)創(chuàng)性指標(biāo)，在ox-LDL等刺激下表達(dá)增高，參與巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL，演變成泡沫細(xì)胞，并激活巨噬細(xì)胞，分泌MIP-1alpha、MCP-1和IL-8等趨化因子，募集更多巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞到粥樣斑塊，并參與激活CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞，參與粥樣斑塊中的炎癥反應(yīng)。靶向抑制siglec-