白藜蘆醇對RSV感染所致氣道炎癥和氣道高反應性的作用及其機制.pdf

1、本文研究了白藜蘆醇對RSV感染所致氣道炎癥和氣道高反應性的作用及其機制。本研究分為三個部分：
　　 第一部分：環(huán)磷酰胺誘導免疫低下BALB/c小鼠RSV感染動物模型的建立。
　　 目的：為了建立RSV感染動物模型,采用環(huán)磷酰胺誘導免疫低下的BALB/c小鼠,觀察是否對低濃度RSV的易感性,此模型更接近臨床患者感染RSV的情況。
　　 方法：BALB/c小鼠分為Control(PBS)組、PBS+RSV組及環(huán)磷酰胺

2、+RSV組(CYP+RSV組),每組10只。CYP+RSV組給予環(huán)磷酰胺100mg/kg腹腔注射,Control組、PBS+RSV組給予同劑量PBS腹腔注射,每天稱體重。環(huán)磷酰胺注射第5d,在10％水合氯醛3ml/kg麻醉下,PBS+RSV組、CYP+RSV組給予RSV3.4×106PFU/ml,100μl滴鼻,Control組給予培養(yǎng)Hep-2細胞上清液100μ l,隨機選取每組中的3只小鼠稱體重至RSV感染后15d,其余均在RSV感

3、染后第5天處死取標本。肺泡灌洗液細胞計數及分類,H&E染色觀察肺組織病理炎癥并進行炎癥評分,空斑實驗檢測小鼠肺組織勻漿RSV病毒滴度,為進一步探討環(huán)磷酰胺對BALB/c小鼠淋巴細胞免疫反應,采用流式細胞技術檢測肺淋巴細胞分類百分比。
　　 結果：CYP+RSV組體重比PBS+RSV組明顯降低,BALF中細胞計數顯示CYP+RSV組小鼠比PBS+RSV組小鼠細胞總數明顯增多,且淋巴細胞比例也增高,巨噬細胞比例降低;H&E染色病理炎

4、癥CYP+RSV組小鼠較PBS+RSV組小鼠白細胞浸潤更加嚴重,病理炎癥評分較高;CYP+RSV組小鼠肺組織勻漿病毒滴度比PBS+RSV組小鼠肺組織滴度增高;流式細胞技術結果顯示環(huán)磷酰胺處理小鼠后CD19比例明顯降低,CD49b比例有所增加,CD3比例兩組比較無明顯差異;RSV感染后,CYP+RSV組較PBS+RSV組CD19比例顯著降低,但是與CYP組相比無明顯差異,CD49b比例CYP+RSV組與PBS+RSV組無明顯差異,CD3比

5、例CYP+RSV組與CYP組及PBS+RSV組相比有所升高。
　　 結論：環(huán)磷酰胺處理后誘導免疫低下小鼠感染RSV肺組織炎癥更重,病毒滴度較高,提示免疫低下小鼠對低濃度RSV易感,可能與環(huán)磷酰胺處理后抑制小鼠肺B淋巴細胞,使得免疫反應降低,抗體的產生減少有關。
　　 第二部分：白藜蘆醇對RSV感染誘發(fā)氣道炎癥和氣道高反應性的作用。
　　 目的：觀察白藜蘆醇對RSV感染環(huán)磷酰胺誘導的免疫低下小鼠氣道炎癥和氣道高反應

6、性的變化,研究白藜蘆醇對RSV誘導的氣道炎癥和氣道高反應性的作用。
　　 方法：BALB/c小鼠分為Control組、RSV+PBS組、RSV+RES組,每組8只:RSV+RES組:環(huán)磷酰胺注射第5d,感染RSV,1-2h后給予白藜蘆醇30mg/kg腹腔注射,連續(xù)給藥5d。RSV+PBS組:環(huán)磷酰胺注射第5d,感染RSV,1-2h后給予PBS(劑量同白藜蘆醇)腹腔注射,連續(xù)注射5d。Control組:環(huán)磷酰胺注射第5d,RSV病

7、毒對照液滴鼻,1-2h后給予PBS(劑量同白藜蘆醇)腹腔注射,連續(xù)注射5d。體積描述記法檢測各組小鼠氣道高反應性,BALF中細胞計數及白細胞分類,空斑實驗檢測肺組織勻漿RSV病毒滴度,H&E染色檢測小鼠肺組織病理炎癥并進行組織形態(tài)學炎癥評分。
　　 結果：白藜蘆醇干預RSV感染后小鼠,RSV+RES組小鼠肺組織勻漿RSV病毒滴度比RSV+PBS組明顯降低;BALF中細胞總數RSV感染后均較Control組明顯增多,淋巴細胞比例明

8、顯增高,巨噬細胞比例明顯減少,給予白藜蘆醇后,RSV+RES組與RSV+PBS組相比,BALF中細胞總數明顯減少,淋巴細胞比例明顯降低,巨噬細胞比例明顯增高:H&E染色病理組織炎癥,RSV感染后炎癥細胞浸潤明顯加重,炎癥病理評分比Control組明顯增高,給予白藜蘆醇后,RSV+RES組與RSV+PBS組相比,炎癥細胞浸潤明顯減輕,炎癥病理評分顯著降低;小鼠吸入乙酰甲膽堿濃度12.5mg/ml-50mg/ml時氣道高反應性,RSV感染后

9、比Control組顯著升高,給予白藜蘆醇后,小鼠吸入乙酰甲膽堿濃度12.5mg/ml-50mg/ml時氣道高反應性,RSV+RES組較RSV+PBS組明顯降低,但與Control組相比仍有所增高。
　　 結論：白藜蘆醇干預RSV感染后小鼠,能夠降低小鼠肺組織勻漿RSV病毒滴度,抑制RSV在體內復制,減輕RSV感染誘導的肺部炎癥,緩解RSV感染誘導的氣道高反應性。
　　 第三部分：白藜蘆醇抑制RSV誘導氣道炎癥和氣道高反應

10、性的機制探討。
　　 目的：研究IFN-γ在白藜蘆醇抑制RSV感染所致氣道炎癥和氣道高反應性中的作用,探討白藜蘆醇抑制RSV誘導氣道炎癥和氣道高反應性的可能機制。
　　 方法：BALB/c小鼠分為Control組、RSV+PBS組、RSV+RES組,每組8只:RSV+RES組:環(huán)磷酰胺注射第5d,感染RSV,1-2h后給予白藜蘆醇30mg/kg腹腔注射,連續(xù)給藥5d。RSV+PBS組:環(huán)磷酰胺注射第5d,感染RSV,1-

11、2h后給予PBS(劑量同白藜蘆醇)腹腔注射,連續(xù)注射5d。Control組:環(huán)磷酰胺注射第5d,RSV病毒對照液滴鼻,1-2h后給予PBS(劑量同白藜蘆醇)腹腔注射,連續(xù)注射5d。ELISA法檢測BALF中炎癥因子、細胞因子表達,Q-PCR檢測TLR3和M2受體的基因表達,Western blot檢測TRIF蛋白表達,為進一步檢測IFN-γ在RSV誘導的氣道炎癥和氣道高反應性的作用,RSV感染后用IFN-γ單抗中和IFN-γ表達,檢測:

12、BALF中細胞計數及白細胞分類,體積描述記法檢測小鼠氣道高反應性。
　　 結果：RSV感染小鼠后,BALF中IFN-γ表達較Control組顯著升高,IL-17,IL-4,IL-10,IL-12,IL-6表達均無明顯差異,給予白藜蘆醇干預后,IFN-γ表達水平RSV+RES組比RSV+PBS組明顯降低,與Control組相比無明顯變化,IL-17,IL-4,IL-10,IL-12,IL-6表達均無顯著差異;給予IFN-γ單抗后,

13、BALF中細胞總數較RSV+PBS組明顯減少,淋巴細胞比例有所降低,巨噬細胞比例有所升高;吸入乙酰甲膽堿濃度12.5mg/ml-50mg/ml時,小鼠氣道高反應性明顯降低,但RSV+anti-IFN-γ組較Control組有所升高;Q-PCR結果顯示RSV感染后小鼠肺組織TLR3表達明顯上調,M2受體表達明顯下降,給予白藜蘆醇干預后,TLR3受體表達有所下調,M2受體表達有所上調,但是給予IFN-γ單抗后M2受體表達無明顯變化;West